Vér alakos elemei Vérkenet készítés Kulcsszavak: vér, vérkenet, vörösvértestek, fehérvérsejtek, thrombocyták, vérképző őssejt Fejszák Nóra 2013. 12. 03. Egészségügyi ügyvitelszervező szak SE, Humánmorfológiai és Fejlődésbiológiai Intézet

A vér A vér a kötőszövettel rokon szövetként is felfogható: Sejtjei között intercelluláris állomány van jelen (vérplazma)

A vér funkciói Tápanyagok, O2, bomlástermékek, CO2szállítása Hormonok szállítása Homeosztázis szabályozása (hőszabályozás, puffer kapacitás) Fertőzések, idegen sejtek és fehérjék, transzformált sejtek elleni védelem Véralvadás A vér speciális, folyékony sejtközötti állománnyal rendelkező szövetnek is tekinthető. 3

-egy felnőtt embernek átlagosan 5 liter vére van, ebből megközelítőleg 0,5 liter tartalék, mely szükség esetén mobilizálható. Ez a vérraktár a következő szervek tágult vénáiban található: máj (200-300 ml), lép, egyéb hasi szervektől (főként a belektől) eredő vénák, bőr alatti vénás fonatok, tüdők, szív. Tehát egy egészséges ember szervezete fél liter vér elvesztését tudja azonnal pótolni anélkül, hogy szövetkárosodás lépne fel. -véradóktól 0,45 liter vért (+ néhány millilitert laborvizsgálatokhoz) vesznek le egy alkalommal. -az elhasznált tartalékvért a szervezet néhány nap alatt pótolja.

A vér összetétele Plazma Alakos elemek Eritrociták (vörösvértestek) 55% -át teszi ki a vérnek Víz Elektrolitok Plazmafehérjék Albumin Fibrinogén Globulinok A vér által szállított anyagok Tápanyagok Bomlástermékek Légzési gázok Hormonok Alakos elemek Eritrociták (vörösvértestek) 99% -át teszik ki a sejteknek; oxigén- és szén-dioxid szállítás. Leukociták (fehér vérsejtek) fertőzés elleni védelem stb. Trombociták (vérlemezkék) véralvadás 5

6

A vér vizsgálata régóta fontos az orvosi diagnosztikában. A vér kémiai, biokémiai vizsgálatán kívül az egyes vérsejtek sajátosságai, számuk, festődésük és molekuláris jellemzőik jól mutatják a szervezetben lezajló normális és pathológiás folyamatokat. Felnőtt ember normál vérképe db/1 ml: Vörösvérsejtek: erythrocyták 4,5-5 millió (ebből 0,5% a reticulocyta) Fehérvérsetjtek: leukocyták 5-7000 ezen belül: neutrophil granulocyta: 60-70% eosinophil granulocyta: 2-3% basophil granulocyta: 0-0,5% lymphocyta: 20-30% Vérlemezkék: 150-200 000

A vér alakos elemei Erythrocyták Trombocyták Leukocyták

Vörösvértestek (erythrocyták) Jellegzetességei: nincs sejtmagjuk; bikonkáv alakjuk van, ami speciális sejtvázat igényel (spektrin, aktin); méretük: lásd ábra. Szerepük: oxigén és szén-dioxid szállítás (hemoglobinhoz kötötten); Élettartam: 120 nap (lebontás: máj, lép) 9

Erythropoiesis (VVT-k kialakulása) Helye: vörös csontvelő Kialakulás időtartama: 8 nap (160 millió/perc) Kiinduló sejt: nagyméretű, sejtmagvas sok sejtorganellum Kromatinállomány kondenzálódik, sejtmag excentrikus lesz, sejtorgellumok száma csökken Hemoglobin szintézis Sejtmag kilökődése, bikonkáv alak megjelenése→ reticulocyta Hemoglobin szintézis leállása→erythrocyta (normoblast)

Diagram of ABO blood groups and the IgM antibodies present in each Vércsoportok A vércsoportok különbözősége abból adódik, hogy különböző szénhidrát-molekulák jelennek meg a vörösvértest felszínén. Ezek a szénhidrátok immunogén anyagok, a szervezet ellenanyagot termel azok ellen a szénhidrátok ellen, amelyek saját vörösvértesteiknek felszínén nem találhatók meg. AB0 vércsoport: 2 antigén: A és B Ezek megléte alapján 4 féle: A, B, AB (mindkét antigén megléte), 0 (itt egyik antigén sem) Ellenanyagok a születés után nem sokkal megjelennek Rh vércsoportrendszer: Kétféle lehet: Rh+ vagy Rh–. Elnevezése: rhesus majomban fedezték fel Rh+ vérű emberek vörös vértestjei rendelkeznek a D-antigénnel, az Rh– vércsoportúak nem. D-antigén elleni immunanyag csak akkor kezd termelődni, ha az Rh– vércsoportú ember vére „találkozik” Rh+ vérrel. (Ennek elsősorban azoknál a várandós anyáknál van jelentősége, akik Rh– vércsoportúak és előzőleg volt már Rh+ magzatuk, és az aktuális embrió is Rh+ vércsoportú. Ez esetben, az anyának anti-D nevű immunoglobulint kell beadni, megelőzendő a védekezőrendszerében termelt ellenanyag okozta magzati károsodást.) Diagram of ABO blood groups and the IgM antibodies present in each http://hu.wikipedia.org/wiki/F%C3%A1jl:ABO_blood_type_hu.svg. 

Vérlemezkék (thrombocyták) Jellegzetességei: sejtmag nélküli citoplazma-fragmentumok, melyek a csontvelői megakaryocytákból válnak le ; élettartamuk: 8-11 nap; számuk: 250-300 000/mm3; méretük: 2-3 µm Szerepük: véralvadás. 12

Véralvadás Thrombocytathrombus: 2. Végleges thrombus: -Endothel folyamatosságának hiánya indítja be -Vérlemezkék kötőszövet (ECM) kollagénjeivel lép kapcsolatba (sejt felszíni kollagén kötő receptor) -Kollagén-kollagén receptor kapcsolat hatására vérlemezkék aktiválódnak (granulumjaikban tárolt anyagok felszabadulnak) -Vérlemezkék egymáshoz kapcsolódva aggregálódnak Véralvadási kaszkád 2. Végleges thrombus: -Vérlemezkékből és a sérült endothelből felszabaduló anyagok hatására beindul a véralvadási kaszkád -A kaszkád végeredménye:, a vérplazmában lévő fibrinogén (oldott) fibrin (oldhatatlan) „szálakká” alakul, a keletkezett hálóban a VVT-k is megtapadnak. http://hu.wikipedia.org/wiki/F%C3%A1jl:Coagulation_full.svg Kép forrása: Nature Reviews Immunology; FIGURE 1 | Platelet functions in haemostasis FROM THE FOLLOWING ARTICLE: John W. Semple, Joseph E. Italiano, Jr & John Freedman; Platelets and the immune continuum; Nature Reviews Immunology 11, 264-274 (April 2011); doi:10.1038/nri2956 ( http://www.nature.com/nri/journal/v11/n4/fig_tab/nri2956_F1.html )

Fehérvérsejtek (leukocyták) Granulocyták Agranulocyták (polymorphonucleáris sejtek) neutrophil granulocyták eosinophil granulocyták basophil granulocyták Agranulocyták (monomorphonukleáris sejtek) lymphocyták monocyták A szervezet védekező rendszerének tagjai, a vérben „utazó” sejtek, majd a szövetekben, nyirokszervekben látják el feladataikat.

Polimorphonuclearis leukocyták (granulocyták)

Neutrofil granulocita Jellegzetességei: méretük 10-15 µm; lebenyes sejtmag (3-5 lebeny); a granulumok aprók és jellegtelen színűek . Gyakoriság: a leggyakoribb fehérvérsejt, 60-70%. Szerepük: kórokozók fagocitálása és elpusztítása. 16

Figure 6-4 Neutrophil

Eozinofil granulocita Jellegzetességei: méretük 10-15 µm; tipikusan kétlebenyű sejtmag; A granulumok eozinofilek tartalmuk: hisztamin, jellemzőek a fehérje kristályok EM-ban. (neurotoxin) Gyakoriság: a fehér vérsejtek 1-6 %-át teszik ki. Szerepük: Ag-Ab komplexek eltakarítása, gyakoriak a tápcsatornában, légutakban (paraziták elleni védekezés) 18

Bazofil granulocita Jellegzetességei: méretük 10-15 µm; lebenyezett sejtmag; nagyszámú durva, erősen bazofil granulum (hisztamin heparánszulfát, ). utóbbi okozza a granulumok festődési tulajdonságait,toluidinkékkel metakromáziás festődés Gyakoriság: a fehér vérsejtek 0-1 % teszik ki. Szerepük: allergiás reakciók effektor sejtjei. 19

A granulocyták összehasonlítása 21

(Monomorphonukleáris leukocyták) Agranulocyták (Monomorphonukleáris leukocyták)

Monociták Jellegzetességei: méretük 15-20 µm; vese alakú sejtmag; citoplazmája szürkéskék HE festésnél; szövetekben makrofággá differenciálódik Gyakoriság: a fehér vérsejtek 2-6 %-át teszik ki. Szerepük: kötőszövetben makrophaggá alakulnak 23

Lymphocyták Jellegzetességei: méretük 8-10 µm; kerek sejtmag, kevés citoplazma; Gyakoriság: a fehér vérsejtek 20-40 %-át teszik ki. Szerepük: celluláris és humorális immunválasz. Típusok: B- és T-limfocita; NK-sejtek (pl.: tumorsejtek ellen) Az akivált lymphocytában megnő a dER mennyisége 25

Plazmasejt sémás rajza (bal) és EM képe (jobb).

A vérképző őssejt fogalma A vérsejtek néhány limfocita kivételével rövid életűek, ezért állandóan pótolni kell őket. A felnőtt, magasabbrendű gerincesekben naponta több billiárd vérsejt képződik, amelyek a csontvelői vérképző őssejtek (multipotens őssejt, hematopoietic stem cell: HSC) leszármazottai.

Őssejtek tulajdonságai Totipotens őssejt: a petesejt és a hímivarsejt fúziójával keletkező megtermékenyített petesejt és az ezt követő első néhány osztódás eredményeként létrejövő utódsejtek. Ezek az őssejtek valamennyi embrionális és extraembrionális sejttípus kialakítására képesek. Pluripotena őssejt: a totipotens őssejtek leszármazottai. Mindhárom csíralemez (ektoderma, endoderma, mezoderma) sejtjeinek kialakítására képesek. (Extraembrionális elemeket már nem hoznak létre, csak embrionálisakat!) Multipotens őssejt: közeli rokonságban álló sejttípussá képesek differenciállódni (pl: vérképző őssejtek, akik képesek VVT, fehérvérsejtek, thrombocyták létrehozására is). Más néven szöveti őssejtek. Unipotens őssejt: egyetlen sejttípus kialakítására képes, de még önmegújító képességgel rendelkezik.

Korai differenciált sejttípus Totipotens őssejt: korlátlan fejlődési potenciállal (ICM, ES) Őssejt: - önmegújító képesség Multipotens őssejtek: korlátozott fejlődési potenciállal (szövetspecifikus őssejtek, ilyen a vérképző őssejt is) - aszimmetrikus osztódással önmagától eltérő sejt létrehozásának képessége Köztes sokszorozó sejt: korlátozott számú osztódás Korai differenciált sejttípus Végdifferenciált sejt

A humán embrióban megjelenő vérképző „őssejtek” szikhólyag máj-lép csontvelő

A vérsejtek eredete Minden vérsejt közös csontvelői ősből származik, mely az ún. őssejtfaktor (Stem Cell Factor-SCF) hatására különböző sejttípusok létrehozására válik elkötelezetté. A prekurzor sejtek citokinek hatására (kolóniastimuláló faktorok) osztódnak és érnek. Ezeket a faktorokat a csontvelőben jelenlevő strómasejtek termelik. 31

Simplified hematopoiesis Author:Mikael Häggström http://en.wikipedia.org/wiki/File:Hematopoiesis_simple.svg

Vérkenet a diagnosztikában Rutineljárás! Kvalitatív vérkép: a fehérvérsejtek sejttípus szerinti összetétele/ százalékos megoszlásának elemzése (patológiás elváltozások azonosítása) Kvantitatív vérkép: vörös,- és fehérvérsejtek számának meghatározása

Kvalitatív elemzés Hemolitikus anaemia Az erythropoesis nagymérvű fokozódása egy határig kompenzálja a vörösvértestek fokozott pusztulását. A granulopoiesis és az erythropoiesis aránya a csontvelőben 1 alattira csökken (normálisan 2-3:1 a granulopoiesis javára), aminek az erythropoiesis fokozódása az oka. Csontvelő-kenet. Krónikus lymphoid leukaemia (CLL) a: monomorf közepes nagyságú lymphocyták keskeny citoplazmaszegéllyel, b: Grumprecht rögök láthatók, ez utóbbiak a szétesett lymphocyták maradványai, CLL-re jellemzőnek tekinthetők. Perifériás vérkenet. SE. I Belgyógyászati Klinika: Haematólógiai diasor http://www.bel1.sote.hu/info.aspx?sp=32&web_id=

Kvantitatív elemzés Bürker-kamra segítségével adott térfogategységben lévő sejtek számát határozzuk meg A vörösvértestek számolására a kis négyzetek (oldalaik 1/20 mm-esek) szolgálnak → területük 1/400 mm2 → fölöttük lévő térfogat 1/4000 mm3 A fehérvérsejtek számolására a nagyobb négyzetek szolgálnak (oldalaik 1/5 mm-esek)→területe 1/25 mm2→fölötte lévő hasáb térfogata 1/250 mm3 A kamra aljzata és a fedőlemez közötti rés 0,1 mm 1/20 mm 1/5 mm

Gyakorlatunk célja Vérkenet készítése Megfestése May-Grünwald-Giemsa oldattal Mikroszkópos megtekintése, egyes sejttípusok megkülönböztetése

Vérkenet készítés lépései Vérvétel ujjbegyből A középső ujj végét alkohollal alaposan fertőtlenítjük. Hüvelykujjunk segítségével a középső ujjpercnél elszorítjuk a vérkeringést; ettől az ujjvég kipirosodik (ha ujjbegyünk nem pirosodik ki, segíthet, ha a fertőtlenítés előtt kezünket lefelé lógatva rázogatjuk, vagy kezünket meleg vízbe áztatjuk). Az egyszer használatos tűről tekeréssel eltávolítjuk a tűt védő sapkát, majd az ujjunkat alulról megtámasztva határozott mozdulattal megszúrjuk. A tűt célszerű nem az ujjbegy közepére, hanem kissé az oldalára illeszteni, így a pici sebből valamivel bővebb vérzést kapunk. A használt tűt azonnal bedobjuk a megfelelő tárolóba. A kiserkenő vér első cseppjét letöröljük (ez nagy mennyiségű egyéb szövetnedvet is tartalmaz), majd megkezdjük a vér levételét. A vérzés lankadása esetén masszírozással serkenthetjük azt.

Vérkenet készítés 1 2 Egy másik tárgylemezt szögben tartva a csepp felé húzzuk A tárgylemezre kis mennyiségű vért cseppentünk ki 3 4 A második tárgylemezt előre mozgatva, maga mögött vékony rétegben teríti szét a vért. A két tárgylemez határán a vércsepp szétfutva egy vékony réteget képez 5 Kész is  !

May-Grünwald-Giemsa festés Vérkenet festésére alkalmas módszer A festés a festékmolekulák és a festendő molekulák közötti elektrosztatikus kölcsönhatáson alapul May-Grünwald: metilénkék, eozin Giemsa: azúr Savanyú festék (anionokban gazdag): eozin→citoplazma, kollagén, izomrostok Bázikus festék (kationokban gazdag): metilénkék, azúr→DNS és RNS negatív foszfátcsoportjait (sejtmag; DER) Festés eredménye: Kék színű: fehérvérsejtek sejtmagvai, citoplazmájuk halványkék a kis mennyiségű RNS miatt; illetve a bazofil granulocyták granulumai Piros színű: vörösvértestek, eozinofil granulocyták granulumai

Festés menete Frissen készített vérkenetet szobahőmérsékleten hagyjuk megszáradni (kb 5 perc) May-Grünwald oldatból, pasteur pipetta segítségével kb 1 ml-t viszünk fel a lemezekre, és 3 percig állni hagyjuk A felvitt May Grünwald oldatot desztvízzel (1:1 arányban) hígítjuk és 3 percig állni hagyjuk Desztvizes mosás Kihígított Giemsa-t (2 ml desztvízbe 3 csepp Giemsa oldat) viszünk fel a lemezekre és 20 percig rajta hagyjuk Szobahőmérsékleten szárítás Lefedés (kanadabalzsammal) Kiértékelés

Baleset és egészségvédelem Lehetőleg mindenki csak a saját vérével dolgozzon Ha a társunknak segítség kell, a segítőnek gumikesztyű használata kötelező A vérvételhez steril és egyszer használatos eszközöket szabad alkalmazni Az ujjbegyet előtte le kell fertőtleníteni A használt tűket erre a célra szolgáló merev falú hulladékgyűjtőbe kell dobni A véres papírvattákat a kommunális hulladéktól szintén elkülönítve kell gyűjteni

Források: H.-Minkó Krisztina: Vér és Immunsejtek, nyirokszervek című előadása Kocsis Katalin: Vérfejlődés, Hemopoesis című előadása Röhlich Pál szerkeszette Szövettan (SE) Gergely János és Erdei Anna által szerkesztett Immunbiológia (ELTE) Zboray Géza: A keringési szervek (ELTE jegyzet) Molecular cell biology, Lodish et al. Molecular biology of the cell, 5. kiadás Alberts et al. http://www.emedinfo.com/blood-cells.html Dr. Magyar Attila és Dr. Nagy Nándor előadásai Képek: internet