Hogyan ismerik fel a sejtek a hibás géntermékeket? A génexpresszió mRNS-szintű minőségbiztosítási rendszerei Mezőgazdasági Biotechnológiai Kutatóintézet Növényi RNS Biológia csoport Silhavy Dániel

A szabályozott génexpresszióhoz szükséges RNS-szintű minőségbiztosítási (quality kontroll) rendszerek. Feladat: csak tökéletes mRNS-ek transzlálódhassanak. 1, A különböző aberráns mRNS-ek felismerésére különféle minőségbiztosítási rendszerek fejlődtek ki. 2, Aberráns mRNS-ek gyors degradációja 3, Vírusok, transzpozonok elleni védekezésben szerep 4, Vad gének szabályozásában is részt vesznek

Az eukarióta mRNS szerkezete PABP eIF4F Start Stop cap AAAAAA kódoló régió 5’UTR 3’UTR Egyszálú, monocisztronos, cap, polyA, megfelelő UTR és kódoló régió RNS silencing (RNAi): kétszálú, cap vagy polyA nélküli Non-stop decay (NSD): stop kodon nélküli mRNS No-go decay (NGD): elongáció elakad. pl. hibás nukleotid A korai STOP kodont tartalmazó mRNS-ek lebontásáért a Nonsense-Mediated mRNA Decay (NMD) rendszer felelős

Jelentőség Az NMD rendszer A PTC-t tartalmazó mRNS-ek lebontásával megelőzi a csonka domináns-negatív fehérjék keletkezését. PTC Start Stop Start Stop polyA polyA mRNS CAP CAP Fehérje Katalitikus domén Regulátor domén Katalitikus domén Jelentőség Egygénes betegségek 1/3-a PTC tartalmú mRNS-t kódol Alternatív splicing termékek 1/3 NMD célpont Vad gének szabályozása: NMD(-) sejt a mRNS-ek 1-10% más -NMD hiány:Drosophila, egér, növény letális, (élesztő kis vált.)

A (növényi) NMD mechanizmusa és az NMD rendszer evolúciója A növényi NMD autoregulációja Az NMD antivirális szerepe Az NMD vad gének regulációjában betöltött szerepe

Az NMD mechanizmusa 1, Az NMD a transzláció terminációja során különbözteti meg a PTC-t az igazi Stop kodontól !!! 2, A PTC tartalmú mRNS-eket a mRNS degradációs rendszerekhez eljuttatni, gyors lebomlás

Az NMD rendszer cisz és az NMD fehérjék elemei Cisz elemek Hosszú 3’UTR-alapú NMD: Élesztő, gerinctelen, PTC 5’UTR Kódoló régió hosszú 3’UTR AAAAAA Intron-alapú NMD: a 3’ UTR-ban stop-tól<50 nt intronok az NMD cisz elemek, emlős PTC I 5’UTR Kódoló régió 3’UTR AAAAAA NMD fehérjék Az NMD komplex kulcs fehérjéi (UPF1, 2, 3) konzerváltak Állatokban az UPF1 foszforegulált: SMG-1 kináz, 14-3-3 fehérjék (SMG-5,-6 ,-7) defoszforiláció Emlősben az EJC elemei is kellenek az NMD-hez

Hosszú 3’ UTR-alapú NMD Vad mRNS NMD célpont mRNS NMD komplex mRNS bontás peptid Upf1 peptid RF3 RF1 RF3 RF1 Upf2 start start Upf3 PABP PABP stop AAA 3’UTR AAA stop hosszú 3’UTR Gyors termináció,stabil mRNS, új transzláció Lassú termináció, NMD, RNS degrad., az adott peptid felszabadulása

Első transzlációs ciklus Intron-alapú NMD I. EX.2 AAA 5’UTR EX.1 3’UTR EJC core komplex: Y14-Mago + 4A3-Barentsz EJC splicing Upf2 Upf3 EJC EX.1 EX.2 AAA 5’UTR 3’UTR Vad mRNS NMD célpont mRNS Upf2 stop PTC Upf2 start Upf3 PABP start Upf3 PABP R EJC AAAA R EJC AAAA Első transzlációs ciklus Upf2 Upf3 RF3 Upf1 RF3 Upf2 RF1 start RF1 start Upf3 PABP R PABP R AAAA EJC AAAA Gyors term.,stabil mRNS,új tr. NMD, RNS degrad., 1 peptid szabadul fel Jellemző: Drasztikus, igen-nem jellegű. Gyors eliminálásra, pulzusszerű expresszióra jó!

Az NMD rendszer feltételezett evolúciója Élesztő Gerinctelen Emlős Hosszú 3'UTR 3’ UTRIntron Hosszú 3'UTR UPF 1,2,3 +SMG 1, 5, 6 UPF 1,2,3 +SMG 1, 5, 6, 7+ EJC UPF 1,2,3 Intron-EJC NMD UPF1Foszforeguláció (SMG 1, 5, 6, 7) Stem eukarióták Hosszú 3'UTR Ősi NMD rendszer egyszerű UPF 1,2,3 Alternatíva (Lynch): Az EJC közvetítette intron-alapú NMD az ősi! Ez magyarázhatná az intron robbanást stem eukariótákban. Célkitűzés: a növényi NMD rendszer jellemzése

Az eukarióták radiációja Növények Zöld alga Plantae Gomba Állat Opisthokont Növény – állat vagy gomba közös, már a stem eukariótában is

Az NMD cisz elemeinek azonosítása I. Stop GFP G-600 G-400 G-200 GFP AAA GFP kontroll 5’UTR 3’UTR PTC GFP 600 5’UTR 3’UTR AAA G-600 PTC GFP 400 G-400 5’UTR 3’UTR AAA PTC GFP G-200 5’UTR 200 3’UTR AAA 1 5% 11% 37% Kertész S, Kerényi Z, Mérai Z, Bartos I, Pálfy T, Barta E, Silhavy D. Nucleic Acids Res. 2006;34(21):6147-57. Epub 2006 Nov 6.

x x x Az NMD cisz elemeinek azonosítása II. NMD G-95i I 95 3’UTR GFP Stop AA - G-95i NMD x G-95 x G-95 95 3’UTR GFP Stop AA - NMD x 5 NMD 4 3 2 1 G-30i G-40i G-50i? G-60i G-70i G-80i G-95i G-95 cont. -Növényekben a hosszú 3’UTR és a 3’UTR intronok is NMD cis elemek -3’UTR intron pozíció függő cis elem, csak > 50-60 nt a stoptól indukál -Mindkét rendszer fokozatosan működik : finomszabályozás

A növényi NMD komponensek azonosítása 1, Feltételezett NMD factor VIGS-silencing 2, NMD riporter konstrukciók expressziója a géninaktivált levélben Stop Control GFP GFP 3’UTR AA Stop hosszú 3’UTR-alapú G-600 GFP 600 AA 3’UTR Stop G-95i GFP 95 AA intron-alapú NMD I 3’UTR VIGS control UPF1 UPF2 UPF3 SMG7 G-600 G-95i GFP

A növényi NMD komponensek azonosítása Intron-alapú NMD gerincesekben és növényekben, mindkettőben a 3’UTR-ban található, a stophoz nem túl közeli intronok indukálnak NMD-t. Emlősben EJC közvetít. Növény? Stop Control GFP GFP 3’UTR AA long 3’UTR-based G-600 GFP 600 AA 3’UTR Stop G-95i GFP 95 AA intron-based NMD I 3’UTR VIGS EJC components Control - UPF1 + Y14 Mago Barentsz 4A3 G-95i G-95i G-95i G-95i G-95i G-95i G-600 G-600 G-600 G-600 G-600 G-600 Növényekben a UPF1,2 ,3 és SMG7 mindkét típusú NMD-hez kell, míg az EJC-faktorok csak az intron-alapú NMD-hez kellenek! A növényi intron-alapú NMD-t feltehetően egy EJC-szerű komplex közvetíti. Kerényi Z, Mérai Z, Hiripi L, Benkovics A, Gyula P, Lacomme C, Barta E, Nagy F, Silhavy D. EMBO J. 2008 Jun 4;27(11):1585-95. doi: 10.1038/emboj.2008.88. Epub 2008 May 1.

Az NMD rendszer evolúciója Fonalas: 3’UTR intron Az NMD rendszer evolúciója Élesztő Drosophila Emlős Növény Hosszú 3'UTR Hosszú 3'UTR 3’ UTRIntron Hosszú 3'UTR, 3’UTRIntron 3’UTRIntron? Hosszú 3'UTR UPF 1,2,3 +SMG1, 5, 6 UPF 1,2,3 UPF 1,2,3 +SMG1, 5, 6, 7+ EJC UPF 1,2,3 +SMG7 + EJC Intron-NMD vesztés Intron-NMD vesztés Stem eukarióták Hosszú 3'UTR, 3’UTRIntron Ősi NMD rendszer komplex UPF 1,2,3 +SMG7 + EJC Élesztő, Drosophila- kevés intron, intron alapú NMD elvesztése Növény: sok intronos és intron nélküli gén, kettős evolúciós nyomás, Fennmaradt hosszú 3’ UTR és intron alapú NMD is.

Működik-e az NMD haploid eukariótákban? pinkava.asu.edu Miért érdekes a Chlamydomonasban vizsgálni az NMD-t? Haploid szervezet Diploid Haploid 1 allél 2 allél NMD! vagy NMD! AAAA PTC cap AAAA PTC cap AAAA PTC cap STOP START AAAA cap Nincs fehérje Csonka (esetleg funkcionális fehérje) ? Ép fehérje

Chlamy NMD cis elemek I Luc-25int. Luc-75int. Stop Stop AAAA Luc i i PsaD 3’UTR i AAAA Luc Luc-25int. 25 nt 75 nt Stop PsaD 3’UTR i Luc-75int. AAAA Luc 75 nt 25 nt 18

7x !! Chlamy NMD cis elemek II G gazdag C gazdag Stop Stop Luc AAAA STOP PsaD 3’UTR GC gazdag 750nt for 750nt rev Luc AAAA STOP PsaD 3’UTR AT gazdag 750nt for 750nt rev 100% vad típus G gazdag C gazdag 7x !! AT gazdag GC gazdag Chlamy: intron- és hosszú 3’UTR-alapú NMD is Nukleotid összetétel befolyásol, C gazdag 3’UTR erős NMD, G (AT) kevésbé erős NMD

3’UTR bázisösszetételének hatása az NMD-re GC% G% C% Chlamy cDNS 70,2 36,64 33,56 Chlamy 3’UTR 58,25 34,55 23,69 növény Chlamy Stop Stop Kódoló régió 3’UTR AA Kódoló C gazdag 3’UTR AA PTC NMD? PTC NMD++ 3’UTR AA C gazdag C C gazdag C 3’UTR AA PTC NMD++ PTC NMD++ C hosszú 3’UTR AA C gazdag hosszú3’UTR AA Haploid Chlamyban van NMD, talán hatékonyabb is! C-gazdag 3’UTR-ok csak egy géncsoportban,a hiszton géneknél??? 20

A (növényi) NMD mechanizmusa és az NMD rendszer evolúciója A növényi NMD autoregulációja Az NMD antivirális szerepe Az NMD vad gének regulációjában betöltött szerepe

x - NMD autoreguláció: az SMG7 rendszer közepes G-SMG7T Splicing NMD hosszú 3’UTR (~750nt) start stop SMG-7: SMG-7 I. 1 I.2 AAAA qRT-PCR: SMG7 mRNS 4-6X NMD mutánsban G-SMG7T SMG-7 3’UTR G-SMG7T GFP I. 1 I. 2 AA +U1DN Az SMG7 3’UTR NMD-t indukál. - x NMD NMD közepes Splicing NMD GFP I. 1 I. 2 AA Hatékony Nagyon erős GFP AA No közepes Hatékony GFP I. 1 AA GFP I. 2 Inkorrect erős AA -Az SMG7 3’UTR mindkét NMD-t érzékeli! -Mindkét 3’UTR introns kell. Mérai Z, Benkovics AH, Nyikó T, Debreczeny M, Hiripi L, Kerényi Z, Kondorosi É, Silhavy D. Plant J. 2013 Jan;73(1):50-62. doi: 10.1111/tpj.12015. Epub 2012 Oct 19

- + + - + - A növényi NMD autoregulációja stop stop hosszú 3’UTR közepes 3’UTR AA SMG-7 I. 1 I.2 AA Barentsz1 ~160nt I. Long 3’UTR-based NMD - + Barentsz Intron-based NMD factor SMG7 Core NMD factor + - + - Intron-based NMD Intron-based NMD UPF3 is autoregulált-Shaul 2015 Nyikó T, Kerényi F, Szabadkai L, Benkovics AH, Major P, Sonkoly B, Mérai Z, Barta E, Niemiec E, Kufel J, Silhavy D. Nucleic Acids Res. 2013 Jul;41(13):6715-28. doi: 10.1093/nar/gkt366. Epub 2013 May 10.

A (növényi) NMD mechanizmusa és az NMD rendszer evolúciója A növényi NMD autoregulációja Az NMD antivirális szerepe Az NMD vad gének regulációjában betöltött szerepe

x A növényi NMD antivirális szerepe I NMD NMD hiányában a PVX hatékonyabban fertőz: növényi NMD antivirális szerepet tölt be!

Az NMD antivirális szerepe állatokban SMV (Semliki Forest Virus) HeLa fertőzés Az NMD számos állati vírus elleni védekezésben is fontos!

Az NMD antivirális szerepe állatokban II Ha NMD hatékony antivirális rendszer, az erős fertőzéshez meg kell kerülni vagy ki kell kapcsolni Hepatitis C Virus NMD célpont gének kontroll gének A HCV elnyomja, szupresszálja az NMD-t!

A (növényi) NMD mechanizmusa és az NMD rendszer evolúciója A növényi NMD autoregulációja Az NMD antivirális szerepe Az NMD vad gének regulációjában betöltött szerepe

A növényi NMD által regulált normál gének RNA-seq UPF1- VIGS control-VIGS RNS metabolizmusban szerepet játszó gének felülreprezentáltak az UPF1-VIGS vonalban. SMG8 -SMG8 kell emlős NMD-hez, SMG1-regulátora. - NMD célpont zárvatermőkben (kivéve Arabidopsis)! - SMG8 inaktiváció mohában - NMD nem működik eRF1-1(RF1-1) Eukaryotic Release Factor1: transzlációs terminációs faktor Konzervált target zárvatermőkben

A Transzkripciós faktorok autoregulációja Transzkripciós gátlás Autoreguláció: protein termék gátolja a saját szintézisét

+1 frameshift stop kontextus Funkció nélküli fehérje Hogyan gátolhatja egy transzlációs terminációs faktor (RF) a saját szintézisét? Ha magas RF szint aberráns terminációt okoz, minden mRNS transzlációja gátlódik Ha a fehérje szekvencia-specifikusan köt nukleinsavakat, könnyű A prokarióta RF2 autoregulációs rendszere RF2 cc-ra érzékeny +1 frameshift stop kontextus UGA AUG UAG ORF1 ORF2 + frame1 Funkció nélküli fehérje Normál termináció ΔC +1 frameshift fehérje RF2 Kevés RF2 +1 Frameshift RF2 Sok RF2 +1 Frameshift RF2 A frameshift kontextus érzékenyebb az RF2 cc.-ra, mint a normál stop kontextus, izolálja az RF2 terminációt az általános terminációtól.

Mi történhet a stop kodonnál? Readthrough (RT) NMD Transzláció terminációja 1.Hatékony termináció, stabil mRNS RF3 stop PABP start 3’UTR RF1 peptid AAA RF3 peptid RF1 start PABP AAA stop 3’UTR AAA 2.Lassú termináció, RT Elongation, stabil mRNS RT stop AAA start 3’UTR RF1 peptid near cognate tRNA PABP RF3 hosszú 3’UTR RF3 3.Lassú terminció, NMD, RNS bontás stop AAA start RF1 peptid PABP Upf1 NMD komplex mRNS decay Upf2 Upf3

Az eRF1-1 NMD érzékeny mRNS speciális szerkezete Arabidopsis RF1 3 kópia, RF1-1, RF1-2 , RF1-3 start RT stop? Next stop 130nt Int. AA At RF1-1 1, 3’ UTR-ban intron – potenciális NMD indukáló elem 2, A stop hasonló a TMV RT stop - potenciális RT STOP RF1 RT? stop: TGA CAA TCA TMV RT stop: TAG CAA TTA 3, A következő in-frame stop (next stop) már az intron után – readthrough elongáció eltávolítja EJC-t, nem okoz NMD-t Arabidopsisban ez az egyetlen ilyen szerkezető mRNS! Az RF1-1 minden zárvatermőben hasonló szerkezetű!

- - - - + Az eRF1 autoregulációja 3 2 1 1, NMD támad eRF1-1 3. eRF1 fehérje hatékonyabbá teszi a readthrough-ot 2, Readthrough részlegesen kimenti az eRF1-1-t az NMD-ből eRF1-2, 1-3 proteins - - 3 Readthrough eRF1 protein 2 + + eRF1-1 protein expr. AA Int. eRF1-1 Next stop RT stop - - 1 NMD Nyikó T, Auber A, Szabadkai L, Benkovics A, Auth M, Mérai Z, Kerényi Z, Dinnyés A, Nagy F, Silhavy D. Nucleic Acids Res. 2017 Apr 20;45(7):4174-4188. doi: 10.1093/nar/gkw1303.

Hogyan alakult ki ez a speciális eRF1 autoreguláció? Baci-növény: azonos probléma, eRF fehérje stabilizálás, egymástól független, konvergens evolúciós megoldás. eRF1 autoreguláció nincs, állatokban, élesztőben Plantae specifikus? (De lehet, hogy fonalas gombában van????)

Az állati NMD által regulált normál gének

(Polypyrimidine track binding protein) Az alternatív splicing (AS) faktorok autoregulációja Az AS faktorok nagyon stabil expresszió! As mRNS-ekben ultrakonzervatív szekvenciák. PTB splicing factor (Polypyrimidine track binding protein) Kevés PTB Sok PTB AAA PTB 10 11 12 10 11 12 - - PTB pre-mRNS 10 11 12 - PTB mRNS 10 12 transzláció PTC AAA PTB PTB AAA PTB AAA NMD AAA PTB Az NMD lebontja a csonka fehérjét kódoló AS terméket, megakadályozza, hogy erről több csonka fehérje keletkezzen! Lareau LF, Inada M, Green RE, Wengrod JC, Brenner SE. Nature. 2007 Apr 19;446(7138):926-9. Epub 2007 Mar 14.

Egér agy minták, az embrionális fejl. eltérő szakaszaiban Az NMD fokozatosságán alapuló finomszabályozás Egér agy minták, az embrionális fejl. eltérő szakaszaiban miR-128 agyspec. miR-128 támad UPF1-et UPF1 Az NMD gátlása ~ezer mRNS szintjének emelkedését okozza, a miR-128 hatás tehát drámaian amplifikálódik!!! Ideg. markerek A neuronális NMD-targetek a hosszú 3’UTR-alapú NMD célpontjai, minél kevesebb UPF1, annál magasabb expr.!

Köszönetnyilvánítás: Az RNS Biológia csoport minden korábbi és jelenlegi tagjának