Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Az oktatott anyagok megtalálhatóak lesznek (korábbi évek már megtalálhatók): vagy a főoldalon keresztül (immunology.unideb.hu)

Hasonló előadás


Az előadások a következő témára: "Az oktatott anyagok megtalálhatóak lesznek (korábbi évek már megtalálhatók): vagy a főoldalon keresztül (immunology.unideb.hu)"— Előadás másolata:

1 Az oktatott anyagok megtalálhatóak lesznek (korábbi évek már megtalálhatók): vagy a főoldalon keresztül (immunology.unideb.hu) belejentkezve: username: student pw: download Letöltések _II régiek:archívum (2010-…) A képanyagok megjegyzés része sok esetben az értelmezést megkönnyítő magyarázatot tartalmaz (pl. akronímák/betűszavak jelentése) számonkérés Biotechnológusok Mol.Biológusok

2 ANTIGÉN, ELLENANYAG -immunogenitás, tolerogenitás -antigén fogalma -epitop (B-, T-sejt epitop) -haptén -hordozó -antigén prezentáció -T independens antigének -szuperantigének -immunoglobulinok -ellenanyag szerkezete -izotípusok -ellenanyagok funkciói -poliklonális és monoklonális ellenanyagok -passzív immunizálás -humanizált ellenanyagok -ellenanyagok felhasználása gyakorlat: -monoklonális ellenanyag termelő hibridóma sejt előállítása -sejtszámolás -gyorsklónozás -ellenanyagok tisztítása affinitás oszlopon

3 ANTIGÉN IMMUNOLÓGIAI FOGALOM Az adaptív immunválasz fogalomkörébe tartozik, B-, T-limfocitákkal, antigén receptorokkal, ellenanyagokkal kapcsolatban beszélünk antigénről. Szinte bármilyen kémiai szerkezet ((de olyan anyagok amik képesek fehérjékkel másodlagos kémiai kötést kialakítani!)) Oldott vagy részecske természetű Egyszerű vagy összetett Szervezetben képződő vagy külső környezetből bejutó Genetikailag saját vagy nem saját Természetes vagy mesterséges

4 Antigén (Ag)Antigén (Ag) - bármely olyan anyag, amelyet az érett immunrendszer felismer és vele szemben specifikus, fajlagos módon reagál (antigén receptor ismeri fel) AntigenitásAntigenitás – az antigén specifikus kötődési képessége az antigén receptorhoz vagy ellenanyaghoz: –immunogenitás –immunogenitás – az antigén képessége az (adaptív) immunválasz beindítására –tolerogenitás –tolerogenitás – az antigén képessége az immunológiai tolerancia kiváltására, specifikus „immun-nemválaszolás” (jellemzően ilyenek pl. a saját antigének) DEFINÍCIÓK

5 A szervezet szempontjából: Genetikai háttér (idegen/saját) –faji hovatartozás (filogenetikai távolság: rokon fajoknak hasonlóak a fehérjéi) –egyéni különbségek (pl. MHC molekulák eltérései) Életkor (újszülött – még nincsenek reagáló sejtjei, időskor – nem képződnek új limfociták) A szervezet fiziológiai állapota (pl. immunodefficiencia, éhezés) AZ IMMUNOGENITÁST BEFOLYÁSOLÓ TÉNYEZŐK I.

6 Az antigén szempontjából: Az antigén fizikai-kémiai sajátságai –méret/komplexitás (nagyobb antigén  több epitóp, „hordozó” szerepe) –korpuszkuláris (sejt, kolloid) vagy oldott állapot –denaturált vagy natív (epitópok!) –lebonthatóság, feldolgozhatóság (antigén prezentáció APC által) Hozzáférhetőség (saját szemlencse krisztallin fehérjék elzártak az immunrendszertől) AZ IMMUNOGENITÁST BEFOLYÁSOLÓ TÉNYEZŐK II.

7 Immunizálási szempontból: Dózis Bevitel módja és útja –Intradermális/szubkután > intravénás > orális > intranazális (a sorrend függ az antigéntől is!) Adjuvánsok –fokozzák az immunrendszer antigén ingerre adott válaszát, de maguk nem immunogének pl: aluminiumsók, Freund-adjuváns, TLR ligandumok AZ ADJUVÁNS HATÁS ÖSSZETETT: depó hatás  az antigén hosszantartó jelenléte a természetes immunitás aktiválása járulékos sejtek aktivációja AZ IMMUNOGENITÁST BEFOLYÁSOLÓ TÉNYEZŐK III.

8 T B A B- és T-sejtek antigén felismerése BCR (membrán Ig) Ellenanyagok (szérum Ig) TCR APC MHC B sejtek natív antigént ismernek fel T sejtek feldolgozott antigént ismernek fel Antigén (animált ábra)

9 Antigén (animált ábra) Antigén: amit az immunrendszer felismer, és vele specifikus módon reagál (felismerés antigén receptorokkal, ellenanyagokkal) Antigén determinánsok avagy epitopok: az antigén azon részei amihez az antigén receptorok vagy az antigén specifikus ellenanyagok közvetlenül kötődnek (másodlagos kémiai kötőerők)

10 Az antigén azon része, melyet egy meghatározott immunglobulin (B sejt receptor vagy ellenanyag) vagy T sejt receptor ismer fel. Antigén determináns avagy epitop Az antigénnek az antigén receptorhoz közvetlenül kapcsolódni tudó része együtt!

11 B sejt epitop T sejt epitop (B sejtek ismerik fel) fehérjék szénhidrátok lipidek nukleinsavak szteroidok mesterséges vegyületek stb. sejtfelszíni, szöveti(kötött) vagy oldott (T sejtek ismerik fel) peptidek (8-23 aminosav) (szigorú méretbeli kötöttség!) APC által történő bemutatás szükséges! (MHC molekulákon) glikolipidek, lipopeptidek - MHC szerű CD1 molekulák segítségével mutatja be az APC. A T sejtek néhány százaléka ismer fel ilyen antigéneket.

12 Antigén determináns (avagy epitop) az antigén azon része, amelyet egy adott immunglobulin (B-sejt receptor, ill. ellenanyag), vagy T- sejt receptor felismerni képes A KOMPLEX ANTIGÉNEK ELVI FELÉPÍTÉSE Hordozó az immunglobulinnal vagy T- sejt receptorral közvetlenül nem reagáló rész (immunizálással, vakcinákkal kapcsolatban kerül elő ez a fogalom) Ezek a fogalmak csak az antigén és egy adott immunglobulin vagy T-sejt receptor viszonylatában értelmezhetők!

13 Epitop és „hordozó” Ellenanyag 1. Ellenanyag 2. Epitop 1. „hordozó” (1.) Epitop 2. „hordozó” (2.) Antigén (animált ábra)

14 Ab1 Ab2 rejtett/feltárt determináns denaturáció új/neoantigén determináns konformációs determinánsok hasítás konformációs/lineáris determinánsok AZ ANTIGÉN DETERMINÁNSOK TÍPUSAI lineáris determináns konformációs determináns (TCR, BCR, Ig)(BCR, Ig) sejtfelszíni/hozzáférhető determináns WB  SDS hatására eltűnhet a konformációs determinánsok egy része, de előkerülhetnek rejtett determinánsok

15 Az antigén bemutatás vázlatos folyamata (lineáris neoepitopok tipikus példája) antigén prezentáló sejt (APC) MHC IMHC II CD8+ Citotoxikus T sejt CD4+ Helper T sejt Endogén fehérjék Exogén fehérjék Az MHC molekulák chaperonnak tekinthetők, amik az antigénből származó (konformáció nélküli) peptid fragmentumot elnyújtott, stabilizált, bemutatható állapotban tartják a prezentáló sejt felszínén. (animált ábra)

16 PepScan: Az antigénből származó peptideket (amik lehetnek egymással átfedő szekvenciájúak is) microarray-szerűségre viszik, és ezt reagáltatják a a tesztelendő ellenanyaggal. Konformációs epitopok esetében nem hatékony. T sejt epitopok esetében megfelelő antigén prezentáló sejtekhez adják a különböző peptideket, és figyelik mely peptidek esetében történik meg a T sejtek aktivációja. Epitop térképezés (Epitop mapping) fehérje antigén (aminosavlánc) peptidek VLGTRNIPS Ala-Scan: Ha már ismert melyik peptidre specifikus az ellenanyag/T sejt, a peptid szekvenciában meghatározhatók a konkrét kontaktusokat kialakító aminosavak. Peptidszintézissel kisebb peptidkönyvtárak hozhatók létre. Az aminosavakat egyesével módszeresen eltérő egyszerű aminosavra pl. alaninra cserélik, és figyelik hogy történik-e változás az ellenanyag kötődésben/T sejt aktivációban. Genetikai módszerek: Site directed mutagenesis Phage display library ALGTRNIPS VLGARNIPS VLATRNIPS VGTRNIP A S stb.

17 Az LPS antigén vagy PAMP/DAMP? Antigén ha antigénreceptor v. ellenanyag ismeri fel PAMP ha mintázat felismerő receptor ismeri fel TLR4 MD2 LPS Fc Az LPS molekula egy glükózamin epitopját specifikusan felismerő ellenanyag Fab

18 ANTIGÉN FELISMERÉS ≠ SEJT AKTIVÁLÁS

19 A B sejtek antigén általi aktivációja hatékony módon szinte csak segítő T sejtek jelenlétében lehetséges De vannak olyan antigének amik nem prezentálódnak citokinek Mindkét sejt aktivációjával jár B sejt aktiváció, izotípus váltás, memória sejtek kialakulása CD40 antigén CD40L (animált ábra)

20 B SEJT T INDEPENDENS ANTIGÉN TI-1 T INDEPENDENS ANTIGÉN TI-2 A B SEJTEK AKTIVÁLÁSA A T SEJTEK KÖZREMŰKÖDÉSE NÉLKÜL – „Tímusz independens antigének” Az antigén különböző részei a BCR-hez és más sejtfelszíni receptorokhoz (pl. LPS-kötő receptor /CD14) egyidejűleg kötődnek Sűrűn elhelyezkedő, ismétlődő, azonos epitópok (pl. szénhidrát komponensek a mikroorganizmusok falában) BCR keresztkötéseket hoznak létre B SEJT AKTIVÁCIÓ további aktivációs szignált biztosít az antigén receptor mellett extenzív receptor keresztkötés/aggregáció jön létre

21 Baktériumok elleni immunizálásnál problémát jelent, hogy a domináns immunogén epitopok főleg bakteriális poliszaharidok. Ezek hiába könnyen előállíthatóak (tisztíthatóak) nem prezentálódnak, ezért nem aktiválnak T sejteket, így nem jön létre pl. memória B sejt válasz, ami a hosszútávú védettséget biztosítaná. Ezért sok poliszaharid vakcinában a cukorláncokat valamilyen immunogén fehérje hordozóhoz konjugálják, hogy T sejt dependens választ tudjon kiváltani. Egy ilyen célra használt fehérje a CRM197  módosított diftéria toxin ( toxoid ) (az eredeti fehérje egy aminosavát kicserélték (Glu  Gly) ami így nem toxikus) A toxoid megőrzi az immunogenitását és önmagában is képes lehet toxin ellenes neutralizáló antitestek termelésének indukciójára. Gyakorlati példa a TI antigének megváltoztatására Prevenar - pneumokokkusz vakcina pneumokokkuszból származó poliszaharidok toxin Glu  Gly toxoid 1. (animált ábra)

22 B sejt poliszaharid segítő T sejt BCR TCRMHCII citokinek, CD40-CD40L toxoid toxoidból származó peptid A pneumokokkusz poliszaharid epitopokat felismerő B sejtek képesek a hordozó fehérje peptidjeit prezentálni a T sejteknek: poliszaharidot felismerő memória B sejtek (  ellenanyag termelő effektor sejtek) baktériumot (bakteriális poliszaharidot) felismnerő hosszú távú ellenanyag termelés 2. (animált ábra)

23 Glikolipidek, lipopeptidek CD1 molekulák segítségével prezentálódhatnak speciális T sejtek számára 1. G. Bricard and S. A. Porcelli: Cell. Mol. Life Sci. Vol. 64, 2007 példák a professzionális APC CD1d molekulái által bemutatott mikrobiális és saját eredetű lipoidokra

24 Glikolipidek, lipopeptidek CD1 molekulák segítségével prezentálódhatnak speciális T sejtek számára 2. Dirk M Zajonc et al.: NATURE IMMUNOLOGY VOLUME 4 NUMBER 8 AUGUST 2003 A CD1 molekula az MHC I molekulához hasonló. A molekula kötőhelyébe a lipoid apoláros szénhidrogén lánca kötődik. A kilógó polárosabb „feji” rész (szénhidrát, peptid, szulfatid) látható a T sejtek számára

25 Glikolipidek, lipopeptidek CD1 molekulák segítségével prezentálódhatnak speciális T sejtek számára 3. Habár a CD1 molekulák az MHC I molekulához hasonlóak, exogén eredetű lipoidok bemutatására is képesek. Dirk M Zajonc et al.: NATURE IMMUNOLOGY VOLUME 4 NUMBER 8 AUGUST 2003 A professzionális fagocita antigén prezentáló sejtek (APC) egy része CD1 molekulái segítségével képes bakteriális glikolipid, lipopeptid antigének hatékony prezentációjára is. A fagocita sejteket fertőzni képes mikobaktériumok elleni immunválsz fontos eszközei.

26 hordozó + haptén Kis méretű molekulák, amelyek önmagukban nem képesek immunválaszt indukálni haptén (pl. DNP: dinitrofenil) ‒ + HAPTÉNEK Nem kellően immunogén anyagok immunogenitása is növelhető azok hordozóhoz kötésével. Ilyen történhet egyes gyógyszerekel, reaktív vegyületekkel is – pl. gyógyszerérzékenység (penicillin – vörösvérsejtek felszínéhez kötődhet) immunválasz

27 szabad hapténhordozóhoz kötött haptének A hordozó immunogenitást fokozó hatása a limfocita aktiváció sajátságaival magyarázható Az antigén receptorokhoz asszociált Src típusú protein kinázok aktivációjának első lépése „auto”foszforiláció. Ehhez a receptoroknak egymás közelébe kell kerülniük (antigén általi keresztkötés/aggregáció) A szabad haptén egyetlen epitoppal rendelkezik és nem tud másik receptort „keresztkötni”. 0 (animált ábra)

28 hordozó specifikus haptén specifikus hordozó+haptén specifikus (konformációs epitop) hordozó+haptén ellenanyag/antitest A HORDOZÓHOZ KÖTÖTT HAPTÉNEK ELLEN IRÁNYULÓ ELLENANYAGOK TÍPUSAI

29 SZUPERANTIGÉNEK Mikrobiális fehérjék. Immunválasz elkerülő mechanizmusok egyik fajtája. Antigén prezentáló sejt (APC) jelenlétében sokféle Vβ típusú T sejt receptort (TCR) hordozó T-sejthez tudnak kötődni. Poliklonális aktiválást eredményeznek. A kötődés nem függ a TCR antigén specificitásától. Hagyományos antigén prezentáció MHC+peptid komplex A szuperantigén az MHC molekulán és a TCR-on nem a peptidkötő helyre kötődik, hanem „kívülről” kapcsolja össze az MHC molekulát a TCR-ral Az ilyen módon aktivált T sejtek anergiásakká válnak vagy aktiváció indukált sejthalál áldozatai lesznek

30 Szuperantigének Konvencionális Antigén Monoklonális/Oligoklonális T sejt válasz  klonális osztódás 1: :10 5 aktiválódó sejtek aránya Szuperantigén Poliklonális T sejt válasz és aktiváció indukált sejtpusztulás vagy anergia 1:4 - 1:10 aktiválódó sejtek aránya Fehérjék, melyek több – megfelelő TCR-t hordozó – T- sejthez tudnak kötődni és aktiválják azokat.

31 B sejt szuperantigének A szuperantigéneket gyakran csak a T sejtekkel hozzák összefüggésbe, pedig hasonló hatású B sejt szuperantigének is Az ellenanyag molekuláknak nem az antigén kötő részéhez hanem valamely más részéhez kötődnek. (pl. Fc rész) Kötődésük független az ellenanyag molekula specificitásától A szuperantigénhez kötött ellenanyag nem képes effektor funkciókat aktiválni. Képes lehet a B sejtek poliklonális aktiválására (pl. SpA).

32 SZUPERANTIGÉNEK OsztályozásForrás Endogén Exogén (T sejt) B sejt 1.Mouse mammary tomor virus (MMTV) (retrovírus, integrálódik a genomba  endogén) 2.Epstein-Barr virus asszociált szuperantigén (EBV) (az EBV egyik fehérjéje egy valódi endogén retrovírális szuperantigént reaktivál)(HERV-K18, ERKV-18) 1.Staphylococcal enterotoxins (SEs): A, B, C1 to C3, D, E, G to Q 2.Staphylococcal toxic shock syndrome toxin-1 (TSST-1) 3.Staphylococcal exfoliative toxins: exoliatin A, exfoliatin B 4.Staphylococcal enterotoxin-like toxins formed due to recombination within enterotoxin gene cluster: U2, V 5.Streptococcal pyrogenic exotoxins (SPEs): A1 to A4, C, G to M 6.Streptococcal mitogenic exotoxins: SMEZ 7.Streptococcal superantigen :SSA 8.Yersinia pseudotuberculosis: Yersinia pseudotuberculosis-derived mitogen (YAM) 9.Mycoplasma species: Mycoplasma arthritidis-derived mitogen (MAM) 10.Cholera toxin: subunit A of cholera toxin 11.Prevotella intermedia* 12.Mycobacterium tuberculosis* 13.Viral superantigens: (a) Mouse leukemia virus (b) IDDMK1222- Ppol-ENV-U3 (c) HIV-Nef (d) Rabies virus-nucleoside protein 1.Staphylococcal protein A 2.Protein G 3.Protein Fv (PFv)

33 Az immunglobulinok (Ig) szerkezete és funkciói

34 Immunoglobulinok (glikoproteinek) Mobilitás alapján gamma-globulin Immunológiai funkció alapján antigén-specifikus fehérjék B sejt membránban antigén felismerő receptor BCR – B sejt receptor Testfolyadékokban (pl. szérum) ellenanyagok, antitestek

35 Az immunoglobulin szerkezete Könnyű és nehéz láncok Diszulfid hidak –láncok közötti –láncon belüli C H1 VLVL CLCL VHVH C H2 C H3 kapocs régió szénhidrát Variabilis és konstans részek Kapocs régió Domének –V L & C L –V H & C H1 - C H3 (C H4 pl. IgM) Oligoszaharid lánc diszulfid híd (-S-S-) NH 2 COOH IgG ~ kDa (eltérő glikoziláltság)

36 Immunoglobulin (szerű) domén: ~12kDa

37 Ribbon structure of IgG

38

39 ELLENANYAGOK IZOTÍPUSAINAK SZERKEZETI JELLEMZÉSE

40 Immunoglobulin fragmentek: Struktúra/Funkció összefüggések feltárása Fab ( F ragment a ntigen b inding) –Ag kötés (valencia=1 monovalens) –Specificitást a V H és a V L domének határozzák meg Papain Fc Fab Fc ( F ragment c rystallizable) VHVH VLVL

41 Pepszin Fc peptidek F(ab’) 2 Immunoglobulin fragmentek: Struktúra/Funkció összefüggések F(ab’)2 –Antigén kötés bivalens! valencia=2 + Az effektor funkciók egy részét Fc régió hiányában továbbra sem képes indukálni, de képes lehet pl. agglutinációra/precipitációra (lásd következő szeminárium)

42 Az immunglobulinok enzimes hasítása segített a szerkezet és funkció sajátságainak vizsgálatában antigén- kötés kötődés az Fc receptorokhoz komplement kötés placentális transzfer

43 Miért szükséges az Fc régió? felismerni az antigént precipitálni az antigént (bivalencia!) blokkolni a toxinok vagy patogénnel asszociált molekulák aktív helyét (neutralizáció) blokkolni a gazdasejt és a patogénnek molekulái közötti kölcsönhatásokat (neutralizáció) az F(ab’) 2 fragmentum képes sejtekkel kapcsolatos gyulladásos és effektor funkciókat a komplement rendszer gyulladásos és effektor funkcióit fagocitózist és az azt követő antigén prezentációs folyamatokat de Fc régió hiányában nem képes aktiválni

44 OSZTÁLY/ALOSZTÁLY ANTIGÉNKÖTŐ HELY A H-lánc (nehézlánc) konstans régiójának típusai, eltérő aminosav szekvencia Ig osztályok: IgG, IgA, IgE, IgD, IgM; alosztályok: IgA1-2, IgG1-4 (könnyűlánc izotípusok: κ, λ) A H- és L-lánc variábilis (V) régióinak egyedi szekvencia variabilitása (klón-specifikus) Az antigén kötő tulajdonságra, az antigén specificitást biztosító molekularészre utal A konstans szekvenciákban található allélikus változatok IgG – „Gm allélek” bizonyos betegségekkel kapcsolatba hozhatóak Egyeden belüli (eltérő funkciójú) típusok Egyeden, vagy akár a többi típuson belül különféle antigéneket felismerő változatok Heterogén populációban az egyedek közötti természetesen jelen levő különféle változatok Ellenanyagok típusaival kapcsolatos fogalmak

45 Humán Immunglobulin Osztályok IgG - gamma (  ) nehézláncok IgM - mü (  ) nehézláncok IgA - alfa (  ) nehézláncok IgD - delta (  ) nehézláncok IgE - epszilon (  ) nehézláncok könnyűlánc típusok kappa (  ) lambda (  ) Izotípusok!

46 A izotípusok között szerkezeti és funkcionális különbségek vannak vagy hexamer (pl. C H domének száma)

47 Szabad IgM pentamer (”csillag”) Antigénhez kötött IgM (”rák”) Az ellenanyagok valenciája (kötésszáma) vagy 12

48

49 ELLENANYAGTERMELÉS és IZOTÍPUSOK A PRIMER ÉS SZEKUNDER IMMUNVÁLASZ SORÁN növekvő szérum ellenanyag titer hetek X-antigén első X-ellenes válasz X-antigén második X-ellenes válasz alacsony magas antigénfüggő x erősebb az első válasznál Az antigénnel való találkozás után az ellenanyagok megjelenéséig eltelő idő Az antigénnel való találkozás és a válasz csúcspontja között eltelt idő Az ellenanyagtermelés mértéke A termelt izotípusok Ellenanyag affinitás B-sejt típus Tulajdonság Elsődleges immunválasz Másodlagos immunválasz

50 szekunder válasz az A antigénnel szemben primer válasz az A antigénnel szemben ellenanyagszint napok primer válasz a B antigénnel szemben Izotípusok megjelenése a primer és szekunder immunválasz során Miért pentamer/hexamer a szolubilis IgM molekula?

51 Az antigén determináns és az ellenenyag antigénkötő ”zsebe” közötti kölcsönhatás modellje A kapcsolatok kialakításáért a leginkább a variábilis régión belüli hivervariabilis részek felelősek

52 Complementary Determining Region (CDR) aminosav pozíció az Ig-lánc V régiójának szekvenciájában Variábilitás (a különböző aminosavak száma) 3 CDR régió 1 V doménen

53 AZ ELLENANYAGOK EFFEKTOR FUNKCIÓI neutralizáció antigén kijelölése az effektor mechanizmusok számára (sokféle effektor mechanizmus) Kétféle fő funkciót lehet megkülönböztetni:

54 Az ellenanyagok effektor funkciói

55 Későbbi szeminárium

56 Immunizálás során a szervezetben létrejött, vagy a passzív immunizálás során bejuttatott ellenanyagok így védenek: pl. vírusfertőzésk ellen, vagy toxinok hatását blokkolhatják, vagy baktériumok adhézióját gátolhatják az epitélsejteken A sejtek károsodnak/fertőződnek A sejteket megvédik a patogént/toxint neutralizáló ellenanyagok NEUTRALIZÁCIÓ az antigén kötéssel direkt módon összefüggő funkció (  Fab is képes rá) A neutralizáló ellenanyag a patogénen levő molekulához vagy toxinhoz kötve meggátolja annak kötődését a célsejten lévő célmolekulához (receptorhoz)

57 Fc receptor mediált funkciók Fc γR : Fc εR : Fc αR : γ  IgG kötés ε  IgE kötés α  IgA kötés FcRn„neonatális” Fc receptorPlacenta, epitél sejtek, stb.IgG transzfer pIgRpoli Ig receptorepitél sejtekIgA, IgM transzfer Fő FcR típusok:

58 OPSZONIZÁLÁS Opszonizáció nélkül a fagocitózis nagyságrendekkel kisebb hatékonysággal megy végbe

59 Az ellenanyag kötődis a sejtfelszíni antigénhez Az NK sejtek receptorai érzkelik a kötött ellenanyagokat Az Fc-receptor keresztkötések aktiválják az NK sejt ölőmechanizmusait A célsejt apoptózissal elhal nagyméretű sejt/patogén ellenanyaggal borítva Citotixikus granulumok tartalmának ürítése Antibody Dependent Cellular Cytotoxicity (ADCC) antitest függő celluláris citotoxicitás

60 Az előző ábrákon az ellenanyagok (több ellenanyag!) először hozzákapcsolódtak az antigénhez, és a kis affinitású Fc receptorok csak így voltak képesek kellően erős aviditással hozzákötni az antigén-antitest komplexhez. A nagy affinitású Fc epszilon receptor képes szabad IgE molekula megkötésére is

61 FcεR általi HÍZÓSEJT DEGRANULÁCIÓ KIVÁLTÁSA antigén specifikus IgE ellenanyagokkal patogén eliminálása (allergiás tünetek) degranuláció antigén specifikus IgE ellenanyaggal „felfegyverzett / szenzitizált” hízósejt Az FcεR-ok keresztkötése a specifikus IgE molekulákhoz kapcsolódó patogénen/allergénen keresztül

62 ELLENANYAG IZOTÍPUSOK KAPCSOLATA AZ EFFEKTOR FUNKCIÓKKAL IgG A különféle izotípusok jellegzetes eloszlást mutatnak a szervezetben

63 Fc receptorok és szállító Fc receptorok FcRn„neonatális” Fc receptorPlacenta, endotél, epittél sejtek, stb. IgG transzfer, IgG megőrzés pIgRpoli Ig receptorepitél sejtekIgA, IgM transzfer

64 Epithel sejt J C C S S S S C C S S S S C C ss J C C S S S S C C S S S S C C ss J C C S S S S C C S S S S C C ss A pIgR és az IgA internalizációja A pIgR elhasítása teszi lehetővé az IgA leválását, ami a továbbiak során ezt a receptor darabot mint „szekretoros fragmentumot” hordozza J C C S S S S C C S S S S C C ss Az IgA és pIgR transzcitózissal vezikulákban átkerül az apikális felszínre A szubmukóza B-sejtjei (BALT, GALT) dimer IgA-t termelnek B A “poli Ig receptorok” (pIgR) az epithel sejtek bazolaterális felszínén találhatóak. Az itt található IgA (és IgM) ellenanyagokat szállítják az apikális felszínre pIgR: A SZEKRETOROS IgA TRANSZPORTJA MUCINMUCIN J C C S S S S C C S S S S C C ss J C C S S S S C C S S S S C C ss J C C S S S S C C S S S S C C ss

65 Mit szállít a pIgR? J lánccal rendelkező (polimer) izotípusokat: IgA, IgM (ez a J lánc nem összekeverendő a VJ/VDJ átrendeződés J régiójával!!!) Hova szállít? bél- és légzőrendszeri felszínek, szekrétumok (nyál, anyatej)

66 Az IgG placentális transzportja: A neonatális Fc  receptor (FcRn) Humán Fc  Rn (Az FcRn és az MHC I molekula szerkezeti rokonságban áll) Humán MHC Class I

67 FcRn, Fc γ Rn (neonatalis Fc receptor) IgG és albumin szállítására képes. Különféle sejttípusokban van jelen: endothel sejtek epiteliális sejtek (emésztő és légutak) újszülött rágcsálók bélrendszerében 100x magasabb az expressziója mint az egyedfejlődés későbbi szakaszában immunrendszer sok sejttípusa, professzionális APC-k

68 FcRnműködése pinocitózis savas közegben nagy affinitással köti az IgG-t, és megmenekíti a lizoszómális lebomlástól Ha az epitélsejt másik oldalán távozik: transzcitózis Az IgG a szervezet leg különfélébb helyeire kerülhet el a keringésből ilyen módon: vérkeringés  szövetek szövetek  epiteliális felszinek (az urogenitális traktusban, a rektumban és a felső légutak egy részében több az IgG, mint az IgA) anyai keringés  magzati keringés

69 Az FcRn miatt az IgG szérum féléletideje kiugróan magas Fc γ Rn túlexpresszáló transzgenikus állatokban nagy mennyiségű poliklonális IgG ellenanyagot termeltethetünk

70 Az Fc γ RII receptoron foszforilálódó ITIM motívumok foszfatázokat toboroznak a jelátviteli utakba. Gátolják az antigén receptor szignálját. B sejt Ag B sejt Fc γ RIIB mediált B sejt feedback reguláció Fc γ RIIb

71 hcIgG: tevefélék (Camelidae) teve, dromedár, láma IgG: ember, egér, patkány Nehéz láncú ellenanyag (hevy chain Ig, hcIg) immunoglobulin new antigen receptor (IgNAR): porcos halak, cápák V H H fragment nanobody vagy sdAb antigén (lizozim)

72 MONOKLONÁLIS ELLENANYAGOK és POLIKLONÁLIS ELLENANYAGOK

73 A TERMÉSZETES ELLENANYAG VÁLASZ POLIKLONÁLIS Ag Immunszérum Poliklonális ellenanyag Ag B-sejt készlet Aktivált B-sejtek Ellenanyag termelő plazmasejtek Antigén-specifikus ellenanyagok (Több klón termékei, különféle epitopokat ismerhetnek fel)

74 Antigén specifikus poliklonális ellenanyagokhoz legegyszerűbben immunizált élőlények szérumából juthatunk. Hosszú távon újabb és újabb immunizálást igényel. - Nehezen standardizálható - Limitált mennyiségben áll rendelkezésre Monoklonális ellenanyagok előállítása Ha fel tudnánk szaporítani valamelyik B sejtet, ami „felismeri” az antigént, sokkal egyszerűbb volna a helyzet. - Gondok lehetnek a specificitással is: ? ? ?

75 Antigén Poliklonális ellenanyagok Monoklonális ellenanyagok (animált ábra)

76 Monoklonális ellenanyagok  egyetlen B-limfocita klón termékei  homogének (antigénspecifitás, affinitás, izotípus)  előnye a poliklonális ellenanyaggal szemben, hogy a meghatározott specificitású és izotípusú ellenanyagok nagy mennyiségben és azonos minőségben állíthatók elő - „in vivo” patológiás körülmények között is előfordulhat pl. mieloma multiplex esetében egy B sejt klón malignus szaporulata miatt nagy mennyiségű monoklonális ellenanyag lehet jelen („gammopátia” – rendelleneség a gamma globulin szérum frakcióban) osztódóképes – tenyészthető, egyféle ellenanyag termelő sejteket kellene előállítani

77 A szérum elektroforézise monoklonális fehérje jelenlétét mutatja ki, amely további vizsgálattal lambda-könnyűláncú IgG-nek bizonyult. normál szérum a beteg széruma Myeloma multiplex

78 Hogyan lehetne monoklonális ellenanyagot előállítani? B sejt transzformáció/immortalizálás vírussal - A vírus ott lesz a termékben is EBV – humán B sejteket transzformál/immortalizál - Az antigén specifikus klónok elkülönítése körülményes

79 Lehetőségek? Fúzió immortális sejtvonallal Követelmények a fúziós partnerrel szemben -ne legyen saját ellenanyag termelése -ne befolyásolja a B sejtek ellenanyag termelését -szelektálhatóság: könnyen megszabadulhassunk a felesleges, nem ellenanyag termelő sejtektől Kevés jó fúziós partner létezik: Egér: Sp2/0-Ag14 (SP2) Humán: nincs igazán jó általános fúziós partner! heteromielómákat, triómákat használnak fúziós partnerként: (maga a fúziós partner is 2-3 sejt hibridje - gyakran egér-humán hibrid) CB-F7, K6H6B5, H7NS, NAT-30, HO-323, A4H12

80 Lehetőségek? Mikromanipuláció (műszerigényes) „FuCell”

81 -Előre szelektált antigén specifikus B sejttel történik (jelölt antigénnel festés) -A B sejtet kontaktusba hozzák a fúziós partnerrel -Elektromos tér segítségével történik a fúzió -Mivel nem szükséges szelektálni, jóval többféle humán fúziós partner szóba jöhet (szinte bármely immortális sejtvonal megfelelő) B sejt fluoreszcens/paramágneses jelzés antigén A fúzió folyamata

82  A számunkra értékes tulajdonsággal rendelkező, de korlátozott élettartamú immunsejtet kiválasszuk, és korlátlan ideig fenntarthatóvá, szaporíthatóvá tegyük.  Antigén specifikus immunsejteket fuzionáltatunk korlátlanul szaporodó tumorsejtekkel. A kapott hibridek közül számunkra azok értékesek, amelyek –kromoszomálisan stabilak, –rendelkeznek az adott immunsejt tulajdonságaival, –és korlátlanul szaporodnak. (antigén specifikus (APC-MHC-peptid), T sejt hibridómák is létrehozhatóak)  A megfelelő hibrid sejteket többlépéses szelekció végeredményeként, sejtklónok formájában kapjuk meg. Monoklonális ellenanyagok előállítása (Több módszer is létezik. A leg elterjedtebb: egér SP2 sejtvonallal végzett sejtfúzió alapú „hibridóma” módszert tekintjük át a következőkben) Georges J.F. Koehler és Cesar Milstein (Nobel díj 1984-ben) A hibridóma technika

83 Monoklonális ellenanyag előállítás menete (vázlatosan) - egér/patkány beoltása antigénnel - a célsejteket tartalmazó lép vagy nyirokcsomók izolálása, homogenizálása - lépből származó plazmasejtek és B-sejt eredetű egér tumorsejtek (plazmacitóma/ mielóma sejtek) fúziója - Az ellenanyag termelő klónok szelekciója/azonosítása (több lépésben) A létrejövő hibridómák folyamatosan szaporodnak és ellenanyagot termelnek, ami a tápoldatukból kinyerhető (1.) (2.)

84 lépsejtmielómasejt (SP2) Napok alatt maguktól elpusztulnak Szaporodó sejtek Sejtfúzió (animált ábra) PEG, Sendai virus, mikromanipulátor+nagyfrekvenciás elektromágneses mező

85 mielómasejt (SP2) Szaporodó sejtek Szelektív tápfolyadék („HAT”) érzékeny HGPRT + TK + lépsejt 1. fő szelekciós lépés HGPRT - TK - (animált ábra) a normál sejtek napokon belül elpusztulnak

86 Antigén specifikus ellenanyagot termelő hibridek Nem antigén specifikus ellenanyagot termelő, vagy ellenanyagot nem termelő hibridek 2. fő szelekciós lépés: Az ellenanyag termelő sejtek kiválasztása Vannak a sejtkultúrában az antigénnel reagálni képes ellenanyagok. Nincs jelen az antigénnel reagálni képes ellenanyag. Eldobjuk Tovább tenyésztjük, sejtklónozzuk. (animált ábra)

87 A sejtklónozás célja Különféle monoklonális ellenanyagokat termelő B sejt hibridóma klónok közül az antigénre specifikusakra van szükségünk (ellenőrzés pl. ELISA módszerrel – lásd a későbbi gyakorlatokon) (animált ábra) A kapott hibridómák összessége poliklonális ellenanyag keveréket termelne, melyek között előfordul antigénre nem specifikus is

88 A „HAT” szelekció biokémiája Hipoxantin, Aminopterin, Timidin tartalmú tápfolyadék nukleotid prekurzor gátlószer A szelektív tápfolyadék:

89 ”de novo” útvonal ”salvage” útvonal aminopterin nukleozid trifoszfátok DNS ”elemi” építökövek, egyszerü szerves anyagok, aminosavak, cukrok egyéb enzimek nukleinsav lebontási termékek felhasználása, purinok, hipoxantin, timin HGPRT, TK (hipoxantin guanin foszforibozil transzferáz, timidin kináz) A DNS szintézis két fő útja (animált ábra) Az SP2 mielóma sejtekben csak ez a „de novo” útvonal működőképes! (HGPRT ‒, TK ‒ )

90 A fúziós partner SP2 sejtvonalnak nincs saját ellenanyag termelése, és nincsenek HGPRT és TK enzimei. Ez teszi ideális fúziós partnerré! Technikai nehézségek: A transzformált sejtvonalak sajnos gyakran genetikailag instabilak. Ez a létrehozott hibridómákra is igaz. Rendszeresen ellenőrizni kell az ellenanyag termelésüket és antigénspecificitásukat – adott esetben újraszelektálni/klónozni Megtörténhet, hogy az SP2„magához tér”és aktív HGPRT és TK jelenik meg benne! Az ilyen SP2 sejtektől egy másik fajta szelekcióval szabadulhatunk meg:

91 ”Abortív” hipoxantin és timidin analógokkal HGPRT - és TK - fúziós partner sejtek szelektálhatóak Ezek a pirimidin és purin vegyületek a HGPRT + vagy TK + sejtek esetében osztódáskor a ”salvage” útvonalon az örökítőanyagba épülve a sejtek pusztulásához vezetnek, élve hagyva a HGPRT - TK - sejteket. Hogyan hozható létre/tartható fent a HGPRT -, TK - (defficiens) fúziós partner sejtvonal?

92 Poliklonális ellenanyag Kis affinitású Monoklonális Ea. Nagy affinitású Monoklonális Ea. Felismert antigén determinánsok száma többegy Specificitás (keresztreaktivitás) polispecifikusgyakran polispecifikusmonospecifikus Affinitáskicsi-nagy (keverék) kicsinagy Nem-specifikus immunglobulinok koncentrációja magas (tisztítástól függ) alacsony (0) Hozam (koncentráció)magasalacsony (tisztítással javítható) Előállítási költségalacsony?magasmagas? Standardizálhatóságnem, ill. nehézkesegyszerű Mennyiséglimitáltkorlátlan Gyakorlati felhasználhatóság módszer függőgyengekiváló A poliklonális és monoklonális ellenanyagok összehasonlítása

93 Monoklonális ellenenyagok általános felhasználási lehetőségei - Immundiagnosztika (tumordiagnosztika - tumor spec mEA-gal) - Sejttípusokra jellemző markerek azonosítása (differenciációs, aktivációs markerek) Immunhisztokémia Lymphomák tipizálása CD markerek segítségével - Sejtek elválasztása (pozitív – negatív szelekció –FACS, Panning, vasszemcsék mágneses térben) CD34+ csontvelői őssejtek gyűjtése autológ/allogén transzplantációhoz perifériás vérből - Vércsoport meghatározás (anti-A, anti-B, anti-D ellenanyagokkal) - Komplex antigén keverékek analizálása (Western, ELISA……) - Sejtfelszíni és oldott molekulák funkcionális vizsgálata T-sejt aktiváltsági állapot vizsgálata / gátlása - Célzott kemoterápia CD20+ B-sejtek elleni antitestek B-sejtes Non-Hodgkin lymphomában Szervátültetés utáni kilökődés megakadályozása célzott T-sejt gátlással Kovalensen kapcsolt, liposzómába zárt toxin - Gyógyszer-eliminálás antitestekkel Digoxin-intoxikáció esetén digoxin ellenes antitestek

94 VÉDETT EGYÉN szérum ellenanyag Humán immunglobulin transzgenikus egér immunizálás egér monoklonális ellenanyagok immunizálás humán monoklonális ellenanyagok humanizált, egér monoklonális ellenanyagok (rekombináns módszerekkel) Passzív immunizálás VESZÉLYEZTETETT EGYED Az immunrendszer nem a szokásos módon aktiválódik Azonnal hat Átmeneti védelem/hatás Immunoglobulin lebomlás!

95 Passzív immunizálás TípusAlkalmazás Intramuszkuláris (kis mennyiségben jut be, kevésbé hatékony) HBV-Ig; Varicella-Zoster-Ig; Anti-D profilaxis Intravénás (IVIG)Humorális immundefektusok (Bruton-féle agammaglobulinaemia; hypogammaglobulinaemiával járó variábilis és kevert immundefektusok ) Méreg elleni ellenanyagok (pl. kígyómarás) Természetes passzív immunizálás: Placentán átjutó IgG – újszülött védelme az első hónapokban Anyatej: IgA – emésztőrendszer és a felső légutak védelme

96 Poliklonális ellenanyagok terápiás felhasználása mérgek elleni antiszérumok (Antivenom) kígyók, skorpiók, pókok, mérges tengeriherkentyűk mérgei elleni antiszérumok nagyméretű állatok fokozatos hiperimmunizációja (általában lovak) tisztított immunglobulin frakció kinyerése a plazmából - csökkenti az immunizálódás valószínűségét és mértékét; a többi szérumfehérje hiányában esetleg többszöri terápiás immunizálás is lehetséges

97 Monoklonális antitestek, mint beadható gyógyszerek? Az egérben termelődő antitestek emberbe oltva - fajidegen fehérjeként - immunválaszt indukálhatnak. (ld. immunogenitást meghatározó tényezők – filogenetikai távolság!) Hogyan kerülhető meg a probléma?

98 A monoklonális antitestek evolúciója Egér / Patkány Kiméra Humán Humanizált A humanizált ellenanyagok glikozilációja a termelő sejttípus (álalában egér) sajátságainak megfelelő. Létrehozhatók valódi humán monoklonális ellenanyagok humán hibridómák segítségével.

99 - Tumorterápia Lehetővé tették a célzott, szelektív kemoterápia következő lépcsőfokának elérését (Sejttípus-specifikus, de még mindig nem csak a malignus sejtekre specifikus!) -Immunszuppresszió Sejttípusra specifikus immunszuppresszió lehetősége Gyógyszerként alkalmazott monoklonális ellenanyagok

100 Monoklonális ellenanyagok a tumorterápiában 1.„Naked MAb”, nem konjugált antitest Anti-CD20 (rituximab – Mabthera/Rituxan, humanizált): B-sejtes Non-Hodgkin lymphoma Anti-CD52 (alemtuzumab – Mabcampath, humanizált): chronicus lymphoid leukaemia (3. vonalban, chlorambucil és fludara rezisztens esetekben) Anti-ErbB2 (trastuzumab – Herceptin, humanizált): emlőtumor Anti-VEGF (bevacizumab – Avastin, humanizált): colorectalis tu. (+ Lucentis!) Anti-EGFR (cetuximab – Erbitux, kiméra): colorectalis tu. (+ Vectibix, rekomb. humán!) 2.konjugált antitest Anti-CD20 + yttrium-90 izotóp (ibritumomab- Zevalin) Anti-CD20 + jód-131 (tositumomab – Bexxar, kiméra!)

101 Immunszuppresszív készítmények 1.Anti-TNF-α antitestek infliximab (Remicade): 1998 óta, kiméra adalimumab (Humira): 2002, rekombináns humán 2.Etanercept (Enbrel) – dimer fúziós fehérje, TNF-α receptor + Ig Fc-vég (Nem monoklonális antitest, csak Ig Fc-véget tartalmaz!) Anti-TNF-α terápia indikációi: Rheumatoid arthritis Spondylitis ankylopoetica (SPA - M. Bechterew) Plakkos psoriasis, arthritis psoriatica Crohn-betegség, colitis ulcerosa (általában - még - nem 1. vonal!)

102 Terápiás monoklonális antitestek elnevezése A gyógyszerként használt monoklonális antitesteket generikus névvel illetik. A nevezéktan sémáját a WHO határozza meg. A nevezéktan részei: Például:Abciximab  ab- + -ci(r)- + -xi- + -mab, egy kardiovaszkuláris megbetegedésekben használt monoklonális kiméra ellenanyag.Abciximab

103 Módosított monoklonáris ellenanyagok alap típusai A módosításokkal tovább csökkenthető a termék immunogenitása, és növelhető a funkciójának specificitása – felesleges/nem kívánatos effektor funkciókat nem indukál (viszont az IgG Fc rész hiányában gyorsabban eliminálódik a szervezetből) (pepszin)(papain)

104 Ellenanyag kapocs régió linker VHVH VLVL első-másod-harmadik generációs kiméra antigén receptorok Kiméra Antigén Receptor (CAR) „tumorantigént” felismerő scFV Effektor citotoxikus vagy toxikus citokin termelő helper T sektekbe transzfektálják (scFV konstrukció, Ig kapocs régió, CD3 zéta lánc ic rész) T sejt receptor CD3 zéta lánca és kostimuláló molekulák jelátvivő részei

105 Ellenanyag tisztítás antigén immunszorbensen (Affinitás kromatográfia) oszlop polimer gyöngyök rákötött antigének oszlop töltelék affinity purifed antibody : a katalógusokból rendelhető ellenanyagokat ezzel a módszerrel tisztítják.

106 tisztítandó ellenanyagok hozzáadása kötődés elúció mosás Antigén specifikus poliklonális ellenanyag (animált ábra)

107 Fehérje(antigén) tisztítás ellenanyag immunszorbensen polimer gyöngy hozzákötött antigén specifikus ellenanyagok oszlop oszlop töltelék Fordítva is összeállítható a rendszer: Tisztítandó oldat felvitele Kötődés Mosás Elúció Tisztított antigén (animált ábra)

108 Immunprecipitáció (Nem azonos az antigén- ellenanyag kapcsolódást követő másodlagos immunológiai reakcióknál tárgyalt precipitációs jelenséggel!!!)

109 gyakorlat

110 A POLIKLONÁLIS ELLENANYAG VÁLASZ Ag Immunszérum Poliklonális ellenanyag Ag B-sejt készlet Aktivált B-sejtek Ellenanyag termelő plazmasejtek Antigén-specifikus ellenanyagok

111 Immunoszorbens Oszlop sepharose gyöngyök BSA

112 Tisztítandó nyúl szérum hozzáadása Inkubáció (animált ábra)

113 Coomassie Brillant Blue G250 festék Nem kötődő fehérjék lemosása PBS Ha nem jön le több fehérje (pl. aspecifikus ellenanyag), a Coomassie festék barna marad. (animált ábra)

114 4-5 ml glicin-HCl pufferrel mosni Kötődő ellenanyagok eluálása az oszlopról TRIS-t tartalmazó csövekbe gyűjtjük 9-10 cseppenként a frakciókat, hogy a pH neutralizálódjon Arról, hogy a farkciószedés közben és végén az oszlopról jön-e még le fehérje, egy-egy Coomassie Brillant Blue-t tartalmazó csőbe cseppentéssel győződhetünk meg (animált ábra)

115 Monoklonális ellenanyagokat a sejtkultúra folyadékból („felülúszóból”) Bakteriális protein A v. protein G oszlopokkal lehet hatékonyan tisztítani. Protein A, Protein G  az ellenanyagok Fc részét kötik meg (a baktérium így is védekezik az ellenanyagok általi felismerés ellen: lekötött Fc rész  nincs effektor funkció)

116 Felező hígítások Újra klónozás limitált hígításos módszerrel (gyorsklónozás): 1. a hibridóma sejteket megszámoljuk lyukú szövettenyésztő lemezre lyukanként 100  l tápfolyadékot kimérünk, majd az első lyukába (A1) sejtet 100  l-ben hozzáteszünk. Belőle felező hígításban a szövettenyésztő lemez-en lefelé, majd oldalirányban is hígítást végzünk: 100  l tápfolyadék/lyuk található a szövettenyésztő lemezen; Az első oszlopban a sejteket tartalmazó (A1-es) lyukból kivett 100ul sejtszuszpenziót hígítjuk lépésekben lefelé, majd az első oszlop lukait 200  l-re kiegészítjük. Ezután sokcsatornás pipettával hasonló módon sorozathígítást végzünk oldalirányban is) A szövettenyésztő lemez jobb alsó részén, így nagy valószínűséggel lesznek olyan lukak, amelyekbe csak 1 db sejt került. Felező hígítások

117 a megszámolt sejtek száma × 10 4 × a korábbi hígításokkal =sejtszám/ml 25 négyzet (pirossal jelölve egy példa) vagy a hármas vonalak által a halványpirossal jelölt módon határolt terület nagysága: 1 mm 2 A fedőlemez és a kamra felület távolsága: 0.1 mm Az így kapott térfogat: 0.1 mm 3 = cm 3 (ml) Bürker kamra (3x3db 4x4-es rács)


Letölteni ppt "Az oktatott anyagok megtalálhatóak lesznek (korábbi évek már megtalálhatók): vagy a főoldalon keresztül (immunology.unideb.hu)"

Hasonló előadás


Google Hirdetések