Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Antigén (animált ábra) (Rövid emlékeztető) Antigén: amit az immunrendszer felismer, és vele specifikus módon reagál Antigén determinánsok avagy epitopok:

Hasonló előadás


Az előadások a következő témára: "Antigén (animált ábra) (Rövid emlékeztető) Antigén: amit az immunrendszer felismer, és vele specifikus módon reagál Antigén determinánsok avagy epitopok:"— Előadás másolata:

1 Antigén (animált ábra) (Rövid emlékeztető) Antigén: amit az immunrendszer felismer, és vele specifikus módon reagál Antigén determinánsok avagy epitopok: az antigén azon részei amihez az antigén receptorok vagy az antigén specifikus ellenanyagok közvetlenül kötődnek

2 A szérumfehérjék globulin frakciójában különülnek el, ezért immuno-globulinoknak (Ig) nevezik őket. Az Ig-ok B sejt antigén receptorként (BCR) B-limfocitákon és a B-sejtekből differenciálódó plazmasejtek által termelt fehérjeként (ellenanyag) jelennek meg. Poliklonális ellenanyagválasz: - A klón szelekciós elv értelmében: mindig egy adott Ag-t felismerő (adott BCR-rel rendelkező) B-limfociták aktiválódnak, osztódnak és differenciálódnak plazmasejtekké. - Ezen folyamatok a perifériás nyirokszervekben mennek végbe - A plazmasejtek által termelt ellenanyagok a keringésbe kerülnek. Az összetett szerkezetű antigének által kiváltott humorális immunválasz során több B-limfocita klón aktiválódik. Ennek eredményeként poliklonális eredetű heterogén ellenanyag-keverék képződik, melyek az antigén különféle részeivel (epitopok v. Ag-determinánsok) reagálnak. Ellenanyagok Immunszérum Antigénnel kimerített szérum α1α1 α2α2 β y + - albumin globulinok Mobilitás Fehérje mennyiség

3 A POLIKLONÁLIS ELLENANYAG VÁLASZ Ag Immunszérum Poliklonális ellenanyag Ag B-sejt készlet Aktivált B-sejtek Ellenanyag termelő plazmasejtek Antigén-specifikus ellenanyagok

4 Immunoszorbens Oszlop sepharose gyöngyök BSA

5 Tisztítandó nyúl szérum hozzáadása Inkubáció

6 Coomassie Brillant Blue G250 festék Nem kötődő fehérjék lemosása PBS Ha nem jön le több fehérje (pl. aspecifikus ellenanyag), a Coomassie festék barna marad.

7 4-5 ml glicin-HCl pufferrel mosni Kötődő ellenanyagok eluálása az oszlopról TRIS-t tartalmazó csövekbe gyűjtjük 9-10 cseppenként a frakciókat, hogy a pH neutralizálódjon Arról, hogy a farkciószedés közben és végén az oszlopról jön-e még le fehérje, egy-egy Coomassie Brillant Blue-t tartalmazó csőbe cseppentéssel győződhetünk meg

8 Monoklonális ellenanyagokat a sejtkultúra folyadékból („felülúszóból”) Bakteriális protein A v. protein G oszlopokkal lehet hatékonyan tisztítani. Protein A, Protein G  az ellenanyagok Fc részét kötik meg (a baktérium így is védekezik az ellenanyagok általi felismerés ellen: lekötött Fc rész  nincs effektor funkció)

9 Antigén specifikus ellenanyagokhoz legegyszerűbben immunizált élőlények szérumából juthatunk. Hosszú távon újabb és újabb immunizálást igényel. - Nehezen standardizálható - Limitált mennyiségben áll rendelkezésre (lásd a táblázatot hátrébb) Ha fel tudnánk szaporítani valamelyik B sejtet, ami „felismeri” az antigént (és az anigén valamelyik részéhez kötődő ellenanyagot termel), sokkal egyszerűbb volna a helyzet. Monoklonális ellenanyagok előállítása Georges J.F. Koehler és Cesar Milstein (Nobel díj 1984-ben)

10 Antigén Poliklonális ellenanyagok Monoklonális ellenanyagok (animált ábra)

11 Monoklonális ellenanyagok  egyetlen B-limfocita klón termékei  homogének (antigénspecifitás, affinitás, izotípus)  előnye a poliklonális ellenanyaggal szemben, hogy a meghatározott specificitású és izotípusú ellenanyagok nagy mennyiségben és azonos minőségben állíthatók elő - „in vivo” patológiás körülmények között is előfordulhat pl. mieloma multiplex esetében egy B sejt klón malignus szaporulata miatt nagy mennyiségű monoklonális ellenanyag lehet jelen („gammopátia” – rendelleneség a gamma globulin szérum frakcióban)

12 Monoklonális ellenanyag előállítás menete Vázlatosan - egér/patkány beoltása antigénnel - lép vagy nyirokcsomók izolálása, homogenizálása - lépből származó plazmasejtek és B-sejt eredetű egér tumorsejtek (plazmacitóma/ mielóma sejtek) fúziója - Az ellenanyag termelő klónok szelekciója/azonosítása A létrejövő hibridómák folyamatosan szaporodnak és ellenanyagot termelnek, ami a tápoldatban feldúsul

13  számunkra értékes tulajdonsággal rendelkező, de korlátozott élettartamú immunsejt kiválasztható, és korlátlan ideig fenntartható, szaporítható.  lényege, hogy aktivált immunsejteket fuzionáltatunk korlátlanul szaporodó tumorsejtekkel. A kapott hibridek közül számunkra azok értékesek, amelyek kromoszomálisan stabilak, rendelkeznek az adott immunsejt tulajdonságaival (ellenanyag- vagy faktortermelő* képesség) és korlátlanul szaporodnak.  A megfelelő hibrid sejteket többlépéses szelekció végeredményeként, sejtklónok formájában kapjuk meg. Monoklonális ellenanyagok elöállítása (Többféle módszer is létezik. A legjobban bejáratott, sejtfúzió alapú „hibridóma” módszert tekintjük át a következőkben) A hibridóma technika lényege ( * pl. citokin termelő, T sejt hibridómák is létrehozhatóak)

14 lépsejtmielómasejt (SP2) Napok alatt maguktól elpusztulnak Szaporodó sejtek Szelektív tápfolyadék érzékeny Antigén specifikus ellenanyagot termelő hibridek Nem antigén specifikus ellenanyagot termelő, vagy ellenanyagot nem termelő hibridek Sejtfúzió (animált ábra)

15 mielómasejt (SP2) Szaporodó sejtek Szelektív tápfolyadék („HAT”) érzékeny HGPRT + TK + lépsejt 1. szelekciós lépés HGPRT - TK - (animált ábra)

16 Antigén specifikus ellenanyagot termelő hibridek Nem antigén specifikus ellenanyagot termelő, vagy ellenanyagot nem termelő hibridek 2. Szelekciós lépés: Az ellenanyag termelő sejtek kiválasztása Vannak a sejtkultúrában az antigénnel reagálni képes ellenanyagok. Nincs jelen az antigénnel reagálni képes ellenanyag. Eldobjuk Tovább tenyésztjük, klónozzuk. (animált ábra)

17 A klónozás célja Antigén specifikus, de különféle antigén determinánsokat felismerő monoklonális ellenanyagokat termelő B sejt hibridóma klónok (animált ábra) A kapott hibridómák összessége még nem antigén specifikus, és poliklonális ellenanyag keveréket termel

18 A „HAT” szelekció biokémiája Hipoxantin, Aminopterin, Timidin tartalmú tápfolyadék A következő három ábra nem tartozik szorosan a témakörhöz, de segíti a megértését prekurzor gátlószer

19 ”de novo” útvonal ”salvage” útvonal aminopterin nukleozid trifoszfátok DNS ”elemi” építökövek, egyszerü szerves anyagok, aminosavak, cukrok egyéb enzimek nukleinsav lebontási termékek felhasználása, purinok, hipoxantin, timin HGPRT, TK (hipoxantin guanin foszforibozil transzferáz, timidin kináz) A DNS szintézis két fő útja (animált ábra)

20 foszforibozil pirofoszfát, glutamin IMP dGTP dATP purinok, pl. hipoxantin dCTP dTTP DNS aszparaginsav, karbamoil foszfát OMP dCDP dTMP timidin ”de novo” útvonal ”salvage” útvonal TK HGPRT HAT  Hipoxantin, Aminopterin, Timidin Ez „ugyan az”, mint az előző ábra, csak részletetezve: aminopterin IMP – inozin monofoszfát OMP – orotidin monofoszfát HGPRT – hipoxantin-guanin foszforibozil transzferáz TK – timidin kináz

21 ”Abortív” hipoxantin és timidin analógokkal HGPRT - és TK - fúziós partner sejtek szelektálhatóak Ezek a pirimidin és purin vegyületek a HGPRT + vagy TK + sejtek esetében osztódáskor a ”salvage” útvonalon az örökítőanyagba épülve a sejtek pusztulásához vezetnek, élve hagyva a HGPRT - TK - sejteket. Hogyan hozható létre a HGPRT -, TK - (defficiens) fúziós partner sejtvonal?

22 Monoklonális ellenenyagok felhasználási lehetőségei - immundiagnosztika (tumordiagnosztika - tumor spec mEA-gal) - Sejttípusokra jellemző markerek azonosítása (differenciációs, aktivációs markerek) Immunhisztokémia Lymphomák tipizálása CD markerek segítségével - Sejtek elválasztása (pozitív – negatív szelekció –FACS, Panning, vasszemcsék mágneses térben) CD34+ csontvelői őssejtek gyűjtése autológ/allogén transzplantációhoz perifériás vérből - Vércsoport meghatározás (anti-A, anti-B, anti-D ellenanyagokkal) - Komplex antigén keverékek analizálása - Sejtfelszíni és oldott molekulák funkcionális vizsgálata T-sejt aktiváltsági állapot vizsgálata - Célzott kemoterápia CD20+ B-sejtek elleni antitestek B-sejtes Non-Hodgkin lymphomában Szervátültetés utáni kilökődés megakadályozása célzott T-sejt gátlással Kovalensen kapcsolt, liposzómába zárt toxin - Gyógyszer-eliminálás antitestekkel Digoxin-intoxikáció esetén digoxin ellenes antitestek

23 Poliklonális ellenanyag Kis affinitású Monoklonális Ea. Nagy affinitású Monoklonális Ea. Felismert antigén determinánsok száma Több (gyakori keresztreakciók) Egy (de gyakori keresztreakciók) Legtöbbször egy Specificitáspolispecifikusgyakran polispecifikusmonospecifikus Affinitáskicsi-nagy (keverék) kicsinagy Nem-spec. Immunglobulinok koncentrációja magasalacsony Hozam (koncentráció)magasalacsony Előállítási költségalacsonymagas Standardizálhatóságnem, ill. nehézkesegyszerű Mennyiséglimitáltkorlátlan Gyakorlati felhasználhatóság módszer függőgyengekiváló A poliklonális és monoklonális ellenanyagok jellemzői

24 Felező hígítások Újra klónozás limitált hígításos módszerrel (gyorsklónozás): 1. a hibridóma sejteket megszámoljuk lyukú szövettenyésztő lemezre lyukanként 100  l tápfolyadékot kimérünk, majd az első lyukába (A1) sejtet 100  l-ben hozzáteszünk. Belőle felező hígításban a szövettenyésztő lemez-en lefelé, majd oldalirányban is hígítást végzünk: 100  l tápfolyadék/lyuk található a szövettenyésztő lemezen; Az első oszlopban a sejteket tartalmazó (A1-es) lyukból kivett 100ul sejtszuszpenziót hígítjuk lépésekben lefelé, majd az első oszlop lukait 200  l-re kiegészítjük. Ezután sokcsatornás pipettával hasonló módon sorozathígítást végzünk oldalirányban is) A szövettenyésztő lemez jobb alsó részén, így nagy valószínűséggel lesznek olyan lukak, amelyekbe csak 1 db sejt került. Felező hígítások

25 ~ * 10 4


Letölteni ppt "Antigén (animált ábra) (Rövid emlékeztető) Antigén: amit az immunrendszer felismer, és vele specifikus módon reagál Antigén determinánsok avagy epitopok:"

Hasonló előadás


Google Hirdetések