Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Elválasztástechnikai Kutató és Oktató Laboratórium Elválasztástechnika kv1n1lv1.

Hasonló előadás


Az előadások a következő témára: "Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Elválasztástechnikai Kutató és Oktató Laboratórium Elválasztástechnika kv1n1lv1."— Előadás másolata:

1 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Elválasztástechnikai Kutató és Oktató Laboratórium Elválasztástechnika kv1n1lv1

2 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Szükséges-e az egyensúly? t A SHS, SPME, SBSE

3 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Származékképzés Miért ? : Mérendő komponens illékonyságának növelése Mérendő komponens termikus stabilitásának növelése Retenciós tulajdonságok megváltoztatása Kimutatási határ csökkentése

4 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Folyadék kromatográfia – HPLC

5 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna 1903 Varsói Természettudományi Társaság Biológiai Közleményei A kezdet

6 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna HPLC vs. GC

7 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna HPLC vs. GC ParaméterGCHPLC Mérendő komponens hőstabilitása Elpárologtatás miatt kell Az analízis általában szobahőmérséklet körül megy Mérendő komponens molekulatömege Jellemzően <700 Csak az oldhatóság jelent határt MintaelőkészítésVégén illékony oldószer Szűrés kell, oldószer legyen az eluenssel elegyedő ÁramlásNyomás vezérelt Áramlási sebesség vezérelt Mozgófázis szerepe a szelektivitásban Nem jellemzőErősen befolyásol

8 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna A HPLC rendszer főbb részei

9 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Mozgó fázis gázmentesítése He sparging, on-line vacuum degassing, refluxing, vacuum filtration, ultrasonication

10 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Automata injektor Pretreatment with automatic injection system:

11 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna HPLC-s módszerek típusai Mérendő komponens MódszerÁllófázisMozgófázis Semleges, gyenge sav, gyenge bázis Fordított fázisú C18,C8,C4, ciano, amino Víz/szerves Módosítók Ionos, savas, bázikus InpárképzésC18, C8 Víz/szerves ionpárképzők VízoldhatatlanNormál fázisú Szilika, ammino, ciano, diol Szerves Szervetlen ionokioncsereioncserélőVizes puffer Nagy molekulatömegű MéretkizárásosSzilika Gélszűrés – vizes Gélpermeáció- szerves

12 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Félpreparativ oszlop 20 mm i.d. Félpreparativ oszlop 8 mm i.d. Analitikai oszlopok 3,0; 4 vagy 4,6 mm i.d. Mikro(bore)oszlopok 1 vagy 2 mm i.d. Kapilláris oszlopok  m i.d. Gyors oszlopok 2,0- 4,6 mm i.d. Preparativ oszlop mm i.d. Oszlopgeometria acél vagy PEEK

13 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Van Deemter egyenlet u (cm/sec) H dp= 10  m dp= 5  m dp= 3  m Nyomásesés a kolonnán:  p- nyomásesés;  - kolonna áramlási ellenállása;  - eluens viszkozitás; L- kolonna hossz; d p - töltet átlagos szemcseméret

14 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna FÉMOXIDOK: SiO 2, Al 2 O 3, CaO, MgO, BaO, TiO 2, CeO 2, ZrO 2, SÓK: SZILIKÁTOK, Mg-Al szilikátok és egyéb összetett vegyületek (Florisil, földpátok, bentonit, kaolin, síkpor, agyag) KARBONÁTOK, SZULFÁTOK (Ca-Mg-karbonát, Ca-szulfát), FOSZFÁTOK (Ca-, Zr-, HIDROXI APATIT) NITRIDEK – BN PORÓZUS ÜVEG SZEMCSÉK (Controlled Pore Glass, CPG μm) CPG GLYCOPHASE (gliceropropilszilán réteggel) SZERVETLEN (SZILIKA) – SZERVES (POLIMEREK) KEVERT TÍPUSOK A folyadékkromatográfiás állófázisok - szervetlen

15 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna SZÉN (aktív C, porózus grafitált karbon, PGC) POLISZACCHARIDOK (cellulóz, keményítő, porcukor) DEXTRÁN (keresztkötésekkel térhálósított gélek, Sephadex) AGARÓZ (agar-agar, agaropektin) POLIAMID POLIAKRILAMID (akrilamid - metilén bis-akrilamid kopolimer) POLIETILÉN IMINEK A folyadékkromatográfiás állófázisok - szerves

16 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Szilika alapú állófázisok Silica SolsXerogels Spherical Irregular Particles are 3-10  m in diameter for standard columns.

17 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Ismétlés vége

18 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Monolit oszlopok

19 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna ALAK-FORMA IRREGULÁRIS – TÖRMELÉK SZEMCSÉK (POROK) GÖMBSZIMMETRIKUS – SZFEROID SZEMCSÉK SZEMCSEMÉRET >1  m ELOSZLÁS - HATÁROK GAUSSI, vagy ASZIMMETRIKUS ELOSZLÁS, HOMODISZPERZ - HETERO(POLI)-DISZPERZ SZERKEZET HOMOGÉN (TÖMÖR) SZEMCSÉK ADHÉZIÓVAL, vagy KÉMIAILAG KÖTÖTT FELÜLETI RÉTEGEK PORÓZUS (PELLICULÁRIS) FELÜLETI RÉTEGEK TÁGPÓRUSÚ (PORÓZUS, PERFUZÍV) TÖLTETEK TÖMBPOLIMER (MONOLIT) OSZLOPOK … HALMAZ ÁLLAPOT SZILÁRD (rigid, xerogél) – GÉL (liogél) – FOLYADÉK STABILITÁS NYOMÁS, HŐ, pH, OLDÉKONYSÁG, BAKTERIÁLIS, KÉMIAI Folyadékkromatográfiás állófázisokról

20 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Állófázisokkal szemben támasztott követelmények Stabilitás (nyomás, hő, pH, oldékonyság, bakteriális, kémiai…) Minél kisebb és homogénebb szemcseátmérő (hatékonyság és nyomásesés) Energetikai homogenitás (visszatartásért felelős helyek homogén eloszlása);

21 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Állófázisok jellemzése  Állófázisok jellemzése: Az átlagos pórus átmérő A fajlagos felület A fajlagos pórustérfogat Pórus átmérő gyakoriság (%) dp (nm) Ideális eloszlás dp átlag  Ne legyen pórusgátlás ( Feltétele hogy a molekula mérete egy nagyságrenddel kisebb legyen mint pórusátmérő) Ideális esetKésőn jön ki (tailing)Beszorul (tailing)

22 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna A szilikagél szerkezete

23 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna A szilikagél felülete Szerkezetéről kevés a megbízható információ (a porózus szilikagél termodinamikailag és kinetikailag nem stabil forma - stabil forma a kristályos szerkezet „kvarc”) OH Si O OH Si O Izolált szilanol csoportok O Si O O O Vicinális szilanol csoportok HH O Si O O O H H O HH Dezaktivált szilanol csoportok Szilikagél határfelülete (pH = 2 – 8) OH Si OO O OH Si O O OH Si O O OH Si O O Szilárd fázis Határfelületen nem disszociált szilanol csoportok

24 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Problémák: Kelát képzés Reaktív/savanyúbb szilanol csoportok Fémszennyezések hatása Legproblémásabb szennyezők: Fe(III), Al (III)

25 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Fémszennyezések hatása

26 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Si CH 3 Si O CH 3 CH 2 NH2NH2 Árnyékoló TávtartóKölcsönható CN NO2NO2 CH(OH)-CH 2 (OH) Módosított szilika állófázisok ….. C 18

27 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna NORMÁL (poláris) FÁZISOK FORDÍTOTT FÁZISOK (RP) - OH (diol) - C2, -C4, -C8, -C18 - CN (ciano) - C 6 H 5 (fenil) - NO2 (nitro) - etil, - NH 2 (amino) - i-propil - N(CH 3 ) 2 (dimetil amino) - i-butil Módosított szilika állófázisok

28 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Módosított szilika állófázisok

29 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Módosított szilika állófázisok

30 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Sterically Protected (non-endcapped) Classic ODS Conventional (non-endcapped) Conventional (endcapped) * Savasan hidrolizálhat Módosított szilika állófázisok

31 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Normál fázisú folyadékkromatográfia

32 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Normál fázisú folyadékkromatográfia (NP) NP: Az álló fázis polárisabb, mint a mozgó fázis Állófázisok Szilikagél (40-50%); Alumínium-oxid (3-10%); Királis állófázis (20-25%); Módosított szilikagél (pl. NH 2, CN, NO 2, diol stb.). Mikor alkalmazzuk? Apoláris vagy kevésbé poláris vegyületek meghatározására; Hexán oldható vegyületek; Helyzeti izomerek elválasztására.

33 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Komponens adszorpcióját befolyásoló tényező Komponens adszorpcióját befolyásoló tényező (minél nagyobb a kötödés, annál nagyobb a visszatartás): a vegyület leszorítja az oldószer molekulákat a szilárd fázis felületéről;  Oldószer víztartalma (H-hidas kötésekkel megakadályozza a vegyületek megkötődését, víztelenítés vízmentes különböző polaritású oldószerekkel vagy N 2 -el szárítás 150  C-on;  Pórusok átmérője;  Szilanol csoportok típusa;  Fémszennyezők jelenléte (polarizálja a szilanol csoportot), a harmadik generációs szilikagélekre a fémtartalom < ppm). Normál fázisú folyadékkromatográfia (NP)

34 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Normál fázisú folyadékkromatográfia  Ritkábban alkalmazzuk, mint a szilikagélt (általában bázikus vegyületeknél);  Gyengébb adszorpciós kölcsönhatást mutat;  Olyan vegyületek vizsgálatára, amelyek savkatalízisre bomlanak;  Alakszelektivitást szeretnénk elérni;  Szilikagéltől eltérő szelektivitás. Aluminium-oxid (pH = 2 – 12 ) u (cm/sec) H általában Al 2 O 3 Mert jobb a pórusszerkezet Ritkábban alkalmazzuk, mint a szilikagélt; Víz dezaktiváló hatás csökkentése; Szelektivitás növelése; A mozgófázis polaritásától függően lehetnek fordított fázisú töltetek!!! Módosított szilikagél (pH = 2 – 8 )

35 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Mozgófázisok (eluens)  Apolárisabb az állófázisnál  Oldja a mintát és ne reagáljon a minta komponensekkel  Detektor kompatibilitás  Megfelelő tisztaságú (szilárd szennyezők, O 2 mentes stb.)  Alacsony viszkozitású (  < 1 cP 25  C-on)  Könnyen beszerezhető, elfogadható áron  Biztonságos (CCl 4 benzol stb. egészségre káros)  Könnyen keveredő  Forrpont (nem túl alacsony buborékképződés miatt) Normál fázisú folyadékkromatográfia (NP)

36 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Alap oldószerek:  Hexán  Heptán  Izooktán Oldhatóság, polaritás növelő oldószerek:  Diklórmetán  Diklóretán  Kloroform (stabilizálás etanollal !!!) Modifikátorok:  Módosító szerek az állófázis felületét megváltoztatják (csökkentik a retenciót);  Fém szennyeződések maszkírozására ecetsavat  Vizet és aminokat nem használunk – irreverzibilisen kötődnek Normál fázisú folyadékkromatográfia (NP)

37 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Fordított fázisú folyadékkromatográfia

38 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Fordított fázisú folyadékkromatográfia (RP) RP: az álló fázis apolárisabb mint a mozgó fázis  Állófázisok Szilikagél alapú; (80-90%) (pH = 2  8); Szerves polimer alapú; (5-10%) (pH = 1  14); Egyéb (szén alapú, zeolit, alumínium-oxid alapú stb.; 2-10%) A leggyakrabban alkalmazott folyadékkromatográfiás módszer (elválasztások 80%-a) ;

39 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Szerves polimer alapú állófázisok -A teljes pH tartományban alkalmazhatóak; -Térhálós szerkezetűknek tulajdoníthatóan nagy mechanikai stabilitással rendelkeznek; -Mikropórusok képződése elkerülhetetlen, így kinetikai hatékonyságuk kisebb mint a szilikagél alapú állófázisoké. SztirolDivinil-benzolKopolimer Fordított fázisú folyadékkromatográfia

40 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Szerves polimer alapú állófázisok -A szerves polimert oldó oldószerek (klórozottak) duzzasztják a polimert, ettől összeroppan -Apoláris jelleg csökkentésére módosítják a polimert (pl. szulfonil, piridin stb.) Polaritást növelő módosítások Fordított fázisú folyadékkromatográfia

41 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Eluenserősség Víz< Metanol

42 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna 42 Az eluensek legfőbb tulajdonságai Tisztaság Viszkozitás Refraktív index Forráspont Toxicitás UV-Cutoff Oldhatóság/elegyíthetőség/oldóképesség

43 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna 43 Solvent Miscibility

44 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Fordított fázisú kromatográfia - mozgófázisok

45 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna A pH szerepe az RP-HPLC-ben Semleges  A pH nem befolyásolja a molekula állapotát, ezért NINCS szükség a pH ellenőrzésére.  Semleges vegyületek: Polikondenzált aromások;Polikondenzált aromások; Halogénezett aromás vegyületek;Halogénezett aromás vegyületek; Alkoholok;Alkoholok; Éterek;Éterek; Ketonok;Ketonok; AldehidekAldehidek Stb.Stb. Fordított fázisú folyadékkromatográfia

46 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna A pH szerepe az RP-HPLC-ben Savas jellegű funkciós csoportot tartalmazó vegyületek  A pH befolyásolja a molekula állapotát, ezért fontos a pH ellenőrzése. R-COOH  R-COO - + H + Ionizált forma (polárisabb-vízoldható ) Nemionizált forma (apolárisabb) Sosem kromatografálunk pH = pKa értéken !!! LeChatelier elv Fordított fázisú folyadékkromatográfia

47 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna A pH szerepe az RP-HPLC-ben pH k pKa Robusztus Robusztus !!! K’ Nem robusztus !!! pH=2 !!! pH=8 pKa-2pKa+2 Fordított fázisú folyadékkromatográfia

48 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna A pH szerepe az RP-HPLC-ben Bázikus jellegű funkciós csoportot tartalmazó vegyületek  A pH befolyásolja a molekula állapotát, ezért fontos a pH ellenőrzése. R-NH 2 + H +  R-NH 3 + Ionizált forma (polárisabb-vízoldható) Nemionizált forma (apolárisabb) pH k pKb Robusztus Robusztus !!! K’ Nem robusztus !!! pH=2 !!! pH=8 pK b -2 pK b +2 Fordított fázisú folyadékkromatográfia

49 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna A pH szerepe az RP-HPLC-ben pH kontroll pufferek segítségével történik (csak szükség esetén használjuk, mert csökkentik az állófázis élettartamát!)  Puffer koncentrációja (2mM-0,2M tartományban)  Gyakran használt pufferek:  Foszfát  Citrát  Trisz(hidroximetil)-aminometán  Acetát  Formiát  Stb. Fordított fázisú folyadékkromatográfia

50 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna A pH szerepe az RP-HPLC-ben Pufferekkel szemben támasztott követelmények:  A  A puffer UV cut-off-ja kisebb mint a detektálási hullámhossz;  Szilárd  Szilárd szennyező mentes (szűrni kell !!!);  Adott  Adott pH-án mikroorganizmusok (alga, baktérium) képződése;  Puffer  Puffer kompatibilitás a szerves oldószerekkel (kicsapódik magas szerves oldószertartalomnál-szerves pufferek oldékonysága nagyobb);  A  A minta stabilitása nagy legyen az adott pufferben;  Puffer  Puffer mentesítés (vízzel kezdjük majd szerves oldószerrel); Fordított fázisú folyadékkromatográfia

51 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna 51 Solvent Handling Solvent Characteristics (Specifications): Purity Viscosity Refractive index Boiling Point Toxicity UV Transparency/UV-Cutoff Solubility

52 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna 52 Solvent Miscibility

53 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Fordított fázisú kromatográfia - mozgófázisok

54 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna 54 Praktikus tanácsok a HPLC-s oszlopokkal kapcsolatban  Avoid any physical stress to the column  Close on both ends to avoid dryness  Store the column well flushed with the appropriate solvent  Record the history of the column

55 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna 55 Column Installation Each column has a defined flow direction! The flow direction is shown by the arrow or direction of writing. Don’t change the flow direction, this will decrease column performance.

56 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna 56 Column Equilibration Equilibrate with mobile phase Do not pressure shock the column column volumes for reversed-phase equilibration. Assures reproducible results.

57 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Column Care and Handling Wash the column after use with selected solvents; flush highly retained sample components from the column. Do not store a column in 100% water. Microbes may grow and clog the column. Don’t open the column and repack the material if you want to maintain performance. Use the column at its optimal flow rate - avoid high flow rates. Do not operate silica or bonded phases for extended periods at high temperature. Keep the pH of the mobile phase in an appropriate range for the column.


Letölteni ppt "Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Elválasztástechnikai Kutató és Oktató Laboratórium Elválasztástechnika kv1n1lv1."

Hasonló előadás


Google Hirdetések