Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Elválasztástechnikai Kutató és Oktató Laboratórium Elválasztástechnika kv1n1lv1.

Hasonló előadás


Az előadások a következő témára: "Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Elválasztástechnikai Kutató és Oktató Laboratórium Elválasztástechnika kv1n1lv1."— Előadás másolata:

1 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Elválasztástechnikai Kutató és Oktató Laboratórium Elválasztástechnika kv1n1lv1

2 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna ALAK-FORMA IRREGULÁRIS – TÖRMELÉK SZEMCSÉK (POROK) GÖMBSZIMMETRIKUS – SZFEROID SZEMCSÉK SZEMCSEMÉRET >1  m ELOSZLÁS - HATÁROK GAUSSI, vagy ASZIMMETRIKUS ELOSZLÁS, HOMODISZPERZ - HETERO(POLI)-DISZPERZ SZERKEZET HOMOGÉN (TÖMÖR) SZEMCSÉK ADHÉZIÓVAL, vagy KÉMIAILAG KÖTÖTT FELÜLETI RÉTEGEK PORÓZUS (PELLICULÁRIS) FELÜLETI RÉTEGEK TÁGPÓRUSÚ (PORÓZUS, PERFUZÍV) TÖLTETEK TÖMBPOLIMER (MONOLIT) OSZLOPOK … HALMAZ ÁLLAPOT SZILÁRD (rigid, xerogél) – GÉL (liogél) – FOLYADÉK STABILITÁS NYOMÁS, HŐ, pH, OLDÉKONYSÁG, BAKTERIÁLIS, KÉMIAI Folyadékkromatográfiás állófázisokról

3 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna A szilikagél felülete Szerkezetéről kevés a megbízható információ (a porózus szilikagél termodinamikailag és kinetikailag nem stabil forma - stabil forma a kristályos szerkezet „kvarc”) OH Si O OH Si O Izolált szilanol csoportok O Si O O O Vicinális szilanol csoportok HH O Si O O O H H O HH Dezaktivált szilanol csoportok Szilikagél határfelülete (pH = 2 – 8) OH Si OO O OH Si O O OH Si O O OH Si O O Szilárd fázis Határfelületen nem disszociált szilanol csoportok

4 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Fémszennyezések hatása

5 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Si CH 3 Si O CH 3 CH 2 NH2NH2 Árnyékoló TávtartóKölcsönható CN NO2NO2 CH(OH)-CH 2 (OH) Módosított szilika állófázisok ….. C 18

6 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna NORMÁL (poláris) FÁZISOK FORDÍTOTT FÁZISOK (RP) - OH (diol) - C2, -C4, -C8, -C18 - CN (ciano) - C 6 H 5 (fenil) - NO2 (nitro) - etil, - NH 2 (amino) - i-propil - N(CH 3 ) 2 (dimetil amino) - i-butil Módosított szilika állófázisok

7 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Módosított szilika állófázisok

8 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Sterically Protected (non-endcapped) Classic ODS Conventional (non-endcapped) Conventional (endcapped) * Savasan hidrolizálhat Módosított szilika állófázisok

9 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Normál fázisú folyadékkromatográfia

10 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Normál fázisú folyadékkromatográfia (NP) NP: Az álló fázis polárisabb, mint a mozgó fázis Állófázisok Szilikagél (40-50%); Alumínium-oxid (3-10%); Királis állófázis (20-25%); Módosított szilikagél (pl. NH 2, CN, NO 2, diol stb.). Mikor alkalmazzuk? Apoláris vagy kevésbé poláris vegyületek meghatározására; Hexán oldható vegyületek; Helyzeti izomerek elválasztására.

11 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Mozgófázisok (eluens)  Apolárisabb az állófázisnál  Oldja a mintát és ne reagáljon a minta komponensekkel  Detektor kompatibilitás  Megfelelő tisztaságú (szilárd szennyezők, O 2 mentes stb.)  Alacsony viszkozitású (  < 1 cP 25  C-on)  Könnyen beszerezhető, elfogadható áron  Biztonságos (CCl 4 benzol stb. egészségre káros)  Könnyen keveredő  Forrpont (nem túl alacsony buborékképződés miatt) Normál fázisú folyadékkromatográfia (NP)

12 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Fordított fázisú folyadékkromatográfia (RP) RP: az álló fázis apolárisabb mint a mozgó fázis  Állófázisok Szilikagél alapú; (80-90%) (pH = 2  8); Szerves polimer alapú; (5-10%) (pH = 1  14); Egyéb (szén alapú, zeolit, alumínium-oxid alapú stb.; 2-10%) A leggyakrabban alkalmazott folyadékkromatográfiás módszer (elválasztások 80%-a) ;

13 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Eluenserősség Víz< Metanol

14 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna A pH szerepe az RP-HPLC-ben pH k pKa Robusztus Robusztus !!! K’ Nem robusztus !!! pH=2 !!! pH=8 pKa-2pKa+2 Fordított fázisú folyadékkromatográfia

15 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna A pH szerepe az RP-HPLC-ben Pufferekkel szemben támasztott követelmények:  A  A puffer UV cut-off-ja kisebb mint a detektálási hullámhossz;  Szilárd  Szilárd szennyező mentes (szűrni kell !!!);  Adott  Adott pH-án mikroorganizmusok (alga, baktérium) képződése;  Puffer  Puffer kompatibilitás a szerves oldószerekkel (kicsapódik magas szerves oldószertartalomnál-szerves pufferek oldékonysága nagyobb);  A  A minta stabilitása nagy legyen az adott pufferben;  Puffer  Puffer mentesítés (vízzel kezdjük majd szerves oldószerrel); Fordított fázisú folyadékkromatográfia

16 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Ismétlés vége

17 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna IZOKRATIKUS t R (min) mAU GRADIENS t R (min) mAU Izokratikus ill. gradiens elúció

18 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna A F A F A B C D E F B+C D+E 30% ACN 70% 20mM Foszfát, pH= % ACN 50% 20mM Foszfát, pH= % ACN 20% 20mM Foszfát, pH=6.95 A: Feniletilamin B: Piridin C: 2-Picolin D: 2,4 Lutidin E: 4-ethylpiridin F: 2,3 dimetilanilin A B C D EF Az eluens erősség változása Izokratikus ill. gradiens elúció

19 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Gradiens elúció

20 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Pumpa, injektor, mixer, kapillárisok…. Gradiens elúció

21 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Gradiens elúció problémák: Egyensúly beállás idő; Mozgófázis tisztasága („0” –lépésként oldószer ellenőrzése); Retenciós sorrend (szelektivitás) változása; Oldószer probléma (k>10 vs. a minta oldása); Detektor kompatibilitás (pl. RI detektor). Gradiens elúció

22 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Viszkozitás – összetétel összefüggés Kísérleti körülmények: Purosphere C18, 5  m; 125*3mm, 25  C 75% AcN 100% AcN 1 ml/perc 0,56ml/perc Gradiens elúció – nyomás profil

23 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna HPLC pumpák fajtái Discontinuous Pumps Continuous Pumps Syringe Pumps Gas driven displacement pump Membrane Pumps Piston Pumps

24 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna 1.Fecskendő típus (Syringe pumpa); Pumpa

25 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Pneumatikus erősítésű (Haskel –típus); levegő levegő eluenseluens szelepszelep Pumpa

26 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna 26 Diaphragm Pumps

27 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Alternáló mozgást végző, dugattyús pumpák. Pumpa

28 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna 28 Dual Piston Parallel Pump Single Piston Delivery Combined Delivery Piston 'A' Advancing Piston B Retracting Check Valves AB Pumphead Piston Rotary Switching Valve

29 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna 29 Dual Piston Pump in Series

30 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna 30 Ballvalves for Reciprocating Piston Pumps

31 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Alternáló mozgást végző, dugattyús pumpák. Előnye: Folyamatos, megbízható működés;Folyamatos, megbízható működés; Egyszerű szerkezet;Egyszerű szerkezet;Hátránya: Pulzálás;Pulzálás; Pulzálás csillapító flexibilis membrán és Kompresszálható folyadék Csoportosítás: Alacsony nyomású; Magas nyomású keverést megvalósító pumpa. Oldószer kompresszibilitás kérdése!!! Pumpa

32 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna 32 Gradient Formation Low Pressure Gradient High Pressure Gradient

33 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Eluensszállító rendszer

34 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Pump summary The pump is the most critical piece of equipment for a successfully operating HPLC. Performance Parameters for HPLC pumps:  Flow Precision  Flow Range  Delay Volume  Pressure Pulse  Composition Precision

35 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna MIP-Molecularly Imprinted Polimer Célvegyület Monomerek Célvegyület Elrendeződés Polimerizáció (UV vagy T) Célvegyület Extrakció MIP - célvegyület

36 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna MIP-alkalmazás MIP-Molecularly Imprinted Polimer

37 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Affinitás kromatográfia

38 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Alkalmazások: Immunaffinitás kromatográfiával az oszlopon megkötött antitestekkel (antibodies) antigéneket tisztítunk; Receptorok, enzimek, DNS fragmensek izolálására; Ellenanyaggal tisztíthatjuk azt a vegyületet, amely az ellenanyagot termelte; Immobilizált antitestekkel toxinokat kötnek meg vérből (hemoperfúzió); Szilárd fázisú immunoassay alkalmazásokban. Az ipar biotechnológiai alkalmazásokban monoklonális antitestek ipari méretekben történő gyártására. Affinitás kromatográfia

39 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Állófázis (mátrix) 90%-ban agar-agar gél, a többi sephadex gél, cellulóz származékok vagy egyéb polimer.Állófázis (mátrix) 90%-ban agar-agar gél, a többi sephadex gél, cellulóz származékok vagy egyéb polimer távtartó ligandum + Affinitás kromatográfia

40 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Kapcsolások hatékonysága 60-75%; Oszlop kapacitása 8-12 mg IgG/ml gél. távtartó OCH 2 CONH(CH 2 ) 2 NHCO(CH 2 ) 2 COO-N CO-CH 2 + IgG-NH 2 Gél NH-IgG Gél NH-IgG Immunoadszorbens Affinitás kromatográfia

41 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna 1. Kondicionálás Puffer Affinitás kromatográfia

42 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Puffer 2. Mintafelvitel és mosás Affinitás kromatográfia

43 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Eluáló szer 2. Eluálás Affinitás kromatográfia

44 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna mintafelvitel Abszorbancia mAU Oszlop térfogat (ot) váltás elúciós pufferre 1-2 ot.x ot.1-2 ot.>1 ot. 1-2 ot. egyensúly Minta megkötődése, egyéb komponensek eluálása Minta eluálása egyensúly Affinitás kromatográfia

45 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna a.Immobilizáljuk a fémet kelát képző ligandumok segítségével; b.Különböző stabilitású komplexek képződnek a fém és olyan proteinek között, amelyek elektron donor csoportot tartalmaznak (pl hisztidin, triptofán, cisztein vagy foszfát csoport). c.A komplex stabilitása függ a ligandum, fém típusától, elektron donor csoport sztérikus hozzáférhetőségétől, hőmérséklettől, pH és kompetitív donor jelenlététől. Alkalmazott pH=6-8. d.Eluálás pH gradienssel vagy a glicin, hisztidin, hisztamin, cisztein koncentrációjának növelésével (N és/vagy S tartalmú vegyületek, amelyek erős elektron donorként leszorítják a proteint a fémről). Immobilizált fém affinitás kromatográfia ( immobilized metal affinity chromatography - IMAC) Affinitás kromatográfia

46 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna A GÉLKROMATOGRÁFIA ELVÁLASZTÁSI MECHANIZMUSÁNAK SZTERIKUS ELMÉLETI MODELLJE Gélkromatográfia

47 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Dalton méretű molekulák méret szerinti elválasztása Dalton méretű molekulák méret szerinti elválasztásaAlkalmazások: Polimerek, polimer adalékok vizsgálata;Polimerek, polimer adalékok vizsgálata; Biopolimerek, peptidek, enzimek elválasztása;Biopolimerek, peptidek, enzimek elválasztása; Molekulatömeg eloszlás, átlag molekulatömeg meghatározás;Molekulatömeg eloszlás, átlag molekulatömeg meghatározás; Minták tisztítása (peszticidek meghatározása élelmiszer mátrixból);Minták tisztítása (peszticidek meghatározása élelmiszer mátrixból); A minta sómentesítése;A minta sómentesítése; Puffer csere.Puffer csere. Gélkromatográfia

48 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Pórusok (dp> 100A  ) Gél szemcse Eltérő méretű molekulákból álló minta Állófázis a kolonnában Nincs kölcsönhatás a minta- molekula és az állófázis között!! Gélkromatográfia

49 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Eltérő méretű molekulákból álló minta Idő (perc) Abs 265nm „Fordított szita” Gélkromatográfia

50 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Teljes kizárási tartomány- az a nagyobb molekulaméret amelynél nincs visszatartás (holt térfogat);Teljes kizárási tartomány- az a nagyobb molekulaméret amelynél nincs visszatartás (holt térfogat); Mérési (működési) tartomány - az a molekulaméret, amelynél van visszatartás;Mérési (működési) tartomány - az a molekulaméret, amelynél van visszatartás; Teljes áteresztési tartomány – nagyon kis molekulák, amelyek teljesen átjárják a pórusokat (a retenciós idő konstans);Teljes áteresztési tartomány – nagyon kis molekulák, amelyek teljesen átjárják a pórusokat (a retenciós idő konstans); Teljes áteresztési tartomány Mérési tartomány Teljes kizárási tartomány lgM V (ml) Gélkromatográfia

51 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Sómentesítés gélkromatográfiával Gélkromatográfia

52 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Antitest tisztaságvizsgálata gélkromatográfiával Gélkromatográfia

53 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna MOLEKULA TÖMEG (MÉRET) MEGHATÁROZÁSA GÉLKROMATOGRÁFIÁVAL Gélkromatográfia

54 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna A MOLEKULA TÖMEGÉNEK ÉS MÉRETÉNEK ÖSSZEFÜGGÉSE A gélkromatográfia alkalmazására vonatkozóan hangsúlyozni kell a molekula tömegének és (virtuális) méretének összefüggését (eltérését), amely a molekula fajlagos parciális térfogatával és a Stokes-féle rádiusszal írható le: M – molekulatömeg, N – Avogadro-féle szám, a – Stokes-féle rádiusz, D – diffuziós állandó, υ – molekula fajlagos parciális térfogata, η – viszkozitási együttható. Gélkromatográfia


Letölteni ppt "Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Elválasztástechnikai Kutató és Oktató Laboratórium Elválasztástechnika kv1n1lv1."

Hasonló előadás


Google Hirdetések