Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Elválasztástechnikai Kutató és Oktató Laboratórium Elválasztástechnika kv1n1lv1.

Hasonló előadás


Az előadások a következő témára: "Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Elválasztástechnikai Kutató és Oktató Laboratórium Elválasztástechnika kv1n1lv1."— Előadás másolata:

1 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Elválasztástechnikai Kutató és Oktató Laboratórium Elválasztástechnika kv1n1lv1

2 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Tételek 1.A kromatogram és kromatográfiás csúcs főbb jellemzői, tányérelmélet 2.A gázkromatográfiás rendszer felépítése, a gázkromatográfia állófázisai 3.Mintabevitel a gázkromatográfiában 4.A gázkromatográfia mozgófázisai, sebességi elmélet 5.Gázkromatográfiás detektorok (kivéve MS) 6.Tömegspektrometriás detektálás a gázkromatográfiában 7.Minta-előkészítés 8.Elektromigrációs módszerek 9.A HPLC-s rendszer felépítése, az egyes elemek szerepe és működése 10.A folyadékkromatográfiás állófázisok fajtái, jellemzése 11.A folyadékkromatográfiás mozgó fázisok és a gradiens elúció 12.Normál fázisú folyadékkromatográfia 13.Fordított fázisú folyadékkromatográfia 14.MIP, affinitáskromatográfia és gélkromatográfia, HIC, HILIC 15.Ionos összetevők elválasztására alkalmas folyadékkromatográfiás módszerek 16.Folyadékkromatográfiás detektorok (kivéve MS) 17.Tömegspektrometriás detektálás a folyadékkromatográfiában

3 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna IZOKRATIKUS t R (min) mAU GRADIENS t R (min) mAU Izokratikus ill. gradiens elúció

4 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Gradiens elúció

5 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Pump summary The pump is the most critical piece of equipment for a successfully operating HPLC. Performance Parameters for HPLC pumps:  Flow Precision  Flow Range  Delay Volume  Pressure Pulse  Composition Precision

6 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna MIP-Molecularly Imprinted Polimer Célvegyület Monomerek Célvegyület Elrendeződés Polimerizáció (UV vagy T) Célvegyület Extrakció MIP - célvegyület

7 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Állófázis (mátrix) 90%-ban agar-agar gél, a többi sephadex gél, cellulóz származékok vagy egyéb polimer.Állófázis (mátrix) 90%-ban agar-agar gél, a többi sephadex gél, cellulóz származékok vagy egyéb polimer távtartó ligandum + Affinitás kromatográfia

8 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Pórusok (dp> 100A  ) Gél szemcse Eltérő méretű molekulákból álló minta Állófázis a kolonnában Nincs kölcsönhatás a minta- molekula és az állófázis között!! Gélkromatográfia

9 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Teljes kizárási tartomány- az a nagyobb molekulaméret amelynél nincs visszatartás (holt térfogat);Teljes kizárási tartomány- az a nagyobb molekulaméret amelynél nincs visszatartás (holt térfogat); Mérési (működési) tartomány - az a molekulaméret, amelynél van visszatartás;Mérési (működési) tartomány - az a molekulaméret, amelynél van visszatartás; Teljes áteresztési tartomány – nagyon kis molekulák, amelyek teljesen átjárják a pórusokat (a retenciós idő konstans);Teljes áteresztési tartomány – nagyon kis molekulák, amelyek teljesen átjárják a pórusokat (a retenciós idő konstans); Teljes áteresztési tartomány Mérési tartomány Teljes kizárási tartomány lgM V (ml) Gélkromatográfia

10 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Ismétlés vége

11 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Ionpár fordított fázisú folyadékkromatográfia

12 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Ionpárképző reagens (Quaterner alkil ammónium só) N+N+ Ion-párképző só [Molekula ION] - Mérendő komponens ionos formája N+N+ [Molekula ION] - C18 szilárd fázis Ionpár fordított fázisú folyadékkromatográfia

13 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Ionpárképző reagens (Alkil szulfonsav só) [Molekula ION] + Mérendő komponens ionos formája C18 szilárd fázis Ionpárképző só S O O O-O- O S O [Molekula ION] + O-O- Ionpár fordított fázisú folyadékkromatográfia Esetleg: CF 3 COO - ; BF 4 - ; ClO 4 -, PF 6 -

14 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna C18 szilárd fázis [ION] + SO 3 - Na + SO3-SO3- [ION] + SO 3 - Na + Na + Módosított állófázis Ionpárképző mechanizmus (ioncserés modell)

15 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Az RP-IP_HPLC-ben változtatható paraméterek: Ionpárképző koncentrációja;Ionpárképző koncentrációja; Ionpárképző jellege (típusa, lánc hossza, stb.)Ionpárképző jellege (típusa, lánc hossza, stb.) Szerves modifikátor típusa, mennyisége;Szerves modifikátor típusa, mennyisége; Puffer koncentrációja, pH-ja;Puffer koncentrációja, pH-ja; Idegen só koncentrációja;Idegen só koncentrációja; Ionpár fordított fázisú folyadékkromatográfia

16 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Ionpár fordított fázisú folyadékkromatográfia – a szerves fázis hatása

17 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Ionpár fordított fázisú folyadékkromatográfia – ionpárképző típusa

18 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Ionpár fordított fázisú folyadékkromatográfia – ionpárképző típusa

19 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Ioncserés folyadékkromatográfia

20 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna A. Ionkizárásos kromatográfia B. Ionkromatográfia Ioncsere: ha az állófázis állandó töltéssel rendelkezik; Ioncserélő kapacitás: megkötött ellentétes ion mennyiség egységnyi tömegű tölteten (mmol/g vagy mekv./g); „Ioncserélő gyanták” Ioncserés folyadékkromatográfia

21 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna KATION CSERÉLŐK Negatív töltésű funkcionális csoportokkal (szulfonil, karbonil, PO 4 - ) ANION CSERÉLŐK Pozitív töltésű (primer, vagy szubsztituált, szekunder, tercier, kvaterner amino, imino, guanidil, stb.) funkcionális csoportokkal AMFOTER (kevert) TIPUSOK Pozitív és negatív töltésű funkcionális csoportokat tartalmazó komplex szerkezettel ERŐS - GYENGE IONCSERÉLŐK DISSZOCIÁCIÓ FOKA (pK A, pK K, pK I ) SZERINT „TENTACLE” ELV - KAPACITÁS ! Ioncserélő töltetek

22 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna pórus Állófázis: nagy ioncserélő kapacitású anion vagy kation cserélő gyanta; Eluens: puffer (ritkán kis szerves oldószer tartalommal); Alkalmazásai: fermentlevek, szeszesital, üdítőital gyártás (cukrok, savak, alkoholok elválasztása) SO - 3 HOOC-R - OOC-R HO-R Cukor Ionkizárásos folyadékkromatográfia

23 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna A szervetlen anionok, kationok vagy vízben oldódó szerves savak és bázisok meghatározására használjuk Állófázis: Állófázis: kis ioncserélő kapacitású anion vagy kation cserélő gyanta; Eluens: Eluens: puffer; Detektor: Detektor: vezetőképesség (elektrokémiai) ionelnyomó után. Ionkromatográfia

24 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna HordozóTípus Jellemzők Üveggyöngy ioncserélő bevonattal Filmszerű (37-44  m) Gyors elválasztás, közepes hatékonyság, kis kapacitás, pH 2-8, szárazon töltik, könnyen beszennyeződik Szilikagél alapú Mikropórusos (10 nm) Közepes gyorsaság, leghatékonyabb, pH 2-8, pépes töltés PolisztirolMikropórusos (10 nm) Lassú, kis hatékonyságú, jó kapacitás, pH 0-12, pépes töltés Ionkromatográfia

25 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Növekvő pH Nő a savak ionizációja – nő a visszatartás; Csökken a bázikus vegyületek ionizációja – gyorsan eluálódnak; Puffer erősség nő Ioncserélő felületeken megnő a versengés – csökken a retenció; Nő a hőmérséklet Egyensúly kedvez a mozgó fázisnak – csökken a retenció. Visszatartást befolyásoló tényezők: Ionkromatográfia

26 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Ionkromatográfia

27 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Vezetőképesség mS Idő (min) Szupresszió előtt Szupresszió után Ionkromatográfia

28 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Az ionelnyomóban lejátszódó folyamatok (eluens NaHCO 3 ): Gyanta-H + + Na + HCO 3 --> Gyanta-Na + + H 2 CO 3 Gyanta-H + + Na + Cl - --> Gyanta-Na + + HCl A mozgófázis vezetőképessége jelentősen csökken, az elválasztott ion vezetőképessége a Na ion (50 S*Cm 2 /equiv.) H ionnal (350 S*cm 2 /equiv.) történő cseréjével jelentősen megnő. Cl - meghatározása Szupresszió ioncserés oszloppal (Regenerálni kell!!) cél: a mozgófázis vezetőképességének csökkentése (S/N növelése) Az ionelnyomóban lejátszódó folyamatok (eluens HCl): Gyanta-OH - + H + Cl - --> Gyanta-Cl - + H 2 O Gyanta-OH - + Na + Cl - --> Gyanta-Cl - + Na + OH - A mozgófázisból víz lesz, a mintában pedig lecseréljük a Cl - (76 S*cm 2 /equiv) ionokat OH - ionokra (198 S*cm 2 /equiv). Na + meghatározása Ionkromatográfia

29 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Alkalmazás (Anion referencia oldat); 0,5M Na 2 CO 3 és NaHCO 3 IonPac® AS14; 4*250mm oszlop és IonPac® AG14; 4*50mm előtétoszlop Ionkromatográfia

30 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Alkalmazás (vízminta); 0,5M Na 2 CO 3 és NaHCO 3 IonPac® AS14; 4*250mm oszlop és IonPac® AG14; 4*50mm előtétoszlop Ionkromatográfia

31 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Ionkromatográfia

32 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna 21 TERMÉSZETES AMINOSAV IONCSERÉLŐ KROMATOGRÁFIÁS ELVÁLASZTÁSA Dionex DC-6A ANIONCSERÉLŐN (30X0,46 cm) 3 LÉPÉSES Na-citrát gradiens DETEKTÁLÁS: NINHIDRIN (post-column) Ionkromatográfia

33 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Hidrofób kölcsönhatású kromatográfia (Hidrophobic Interaction Chromatography, HIC)

34 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Hidrofób kölcsönhatású kromatográfia

35 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Hidrofób kölcsönhatású kromatográfia

36 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Mindkét technikában közös és jellemző: - Az álló fázis a hordozóra kötött apoláris ligandum. - A szorpció oka a hidrofób (apolárIs) kölcsönhatás. - A retenciót döntő módon a hidrofóbicitási viszonyok határozzák meg. - Alkalmasak fehérjék elválasztására. HIC vs. RPC

37 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna KÜLÖNBSÉGEK: - A HIC liganduma gyengébben apoláris, kisebb a felületi koncentrációja. -A HIC esetén sokkal gyengébb a szorpció, a fehérje natív formában (folded) marad, kisebb a denaturáció esélye. -A RPC esetében az erős szorpció megszüntetheti az eredeti struktúrát (unfolding), itt a retenciót elsősorban az elsődleges szerkezet hidrofób jellege határozza meg. - A RPC esetében a fehérje spontán kötődik a ligandumhoz. Az elúciót szerves oldószer adagolása okozza. A HIC esetében a fehérje kötődése a tölteten és a retenció mértéke a kozmotróp só adagolásával érhető el. Az elúció a só negatív koncentráció gradiensének eredménye. -A RPC esetében a hidrofób kölcsönhatásért döntően az álló fázis (ligandum) felelős, a HIC esetében az áramló fázis (eluens) a domináns tényező HIC vs. RPC

38 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Hidrofil kölcsönhatású folyadékkromatográfia (Hidrophilic Interaction Liquid Chromatography; HILIC)

39 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna HILIC Állófázis: mint a normál fázisú kromatográfiában Eluens: mint a fordított fázisú kromatográfiában 3-40% vízzel (A víz az erős oldószer !!!) Alkalmazásai: RP-hez túl poláros, nehezen visszatartható komponensek elválasztására

40 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Detektorok

41 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna A detektorok legfőbb jellemzői Destruktív – nem destruktív Szelektív – univerzális Érzékenység Linearitási tartományDinamikus tartomány

42 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Komponensek tulajdonságát észlelik  UV- látható abszorbancia detektor (UV- VIS)  Fluoreszcenciás detektor (FLD)  Elektrokémiai detektor (ECD)  Radiokémiai detektor (RD)  Tömeg detektorok (MSD) Előnyök: specifikusság, érzékenység, szelektivitás Hátrányok: minden vegyület más (pl. más UVmax) A folyadékkromatográfiás detektorok

43 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Mozgófázis tulajdonságát észlelik  Törésmutató detektor (RID)  Vezetőképesség detektor (CD)  Fényszórásos detektor (LSD) Előnyök : nagyon sok komponensre – majdnem univerzális Hátrányok: zaj, érzékenység A folyadékkromatográfiás detektorok

44 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna UV-VIS detektor Alapelv: Lambert-Beer törvény

45 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Chromophore Amine Ethylene Ketone Ester Aldehyde Carboxyl Nitro Phenyl Naphthyl - NH - C = C - C = O - COOR - CHO - COOH - NO , , 275 max(nm) Structure UV-VIS detektor

46 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna UV-VIS detektor – UV spektrum  Kromatográfiás elválasztás;  Minél magas hullámhossz annál szelektívebb  max pH függése  oldószerek, adalékok UV elnyelése Hullámhossz (nm) Abszorbancia (mAU) Benzamidofenol Paracetamol 280 nm

47 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna UV-VIS detektor – UV Cutoff SolventUV Cutoff (nm) Acetonitrile190 Water190 Cyclohexane195 Hexane200 Methanol210 Ethanol210 Diethyl Ether220 Dichloromethane220 Chloroform240 Carbon Tet265 Tetrahydrofuran280 (220) Toluene285 UV cutoff is the wavelength at which absorbance equals 1, measured in a 1 cm cell with air as a reference.

48 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna VWD – Variable Wavelenght detector Átfolyó cella Diffrakciós rács tükör tükör Mintafotodióda tükör tükör deutérium lámpa Fénynyaláb osztó A diffrakciós rács monokromatikus fényt állít elő A monokromatikus fényt megosztjuk a referencia és minta fotodióda között Az intenzitásbeli különbséget a cellában történő abszorbancia okozza lencse

49 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Diódasoros detektor – DAD, Diodarray detector Diode Array Grating Optical Slit Detector Flow Cell Homium Filter Achromatic Lens UV Lamp Vis Lamp

50 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Deutérium lámpa tesztje

51 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna On-line spektrum Wavelength Time Absorbance Spectra

52 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Csúcstisztaság Spectral differences at different points of peak elution Peak with time marker for spectra selection


Letölteni ppt "Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Elválasztástechnikai Kutató és Oktató Laboratórium Elválasztástechnika kv1n1lv1."

Hasonló előadás


Google Hirdetések