Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Elválasztástechnikai Kutató és Oktató Laboratórium Elválasztástechnika kv1n1lv1.

Hasonló előadás


Az előadások a következő témára: "Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Elválasztástechnikai Kutató és Oktató Laboratórium Elválasztástechnika kv1n1lv1."— Előadás másolata:

1 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Elválasztástechnikai Kutató és Oktató Laboratórium Elválasztástechnika kv1n1lv1

2 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna UV/VIS detektorhoz képest:  Érzékenyebb  Szelektívebb (Csak fluoreszkáló komponensek detektálására alkalmas) Fluoreszcenciás detektor – FLD

3 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Fluoreszcenciás detektor – FLD

4 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Az antracén gerjesztési és emissziós spektruma metanolban   h 1 Vibrációs alszintek excitation h 2 emisszió Wavelength / nm Intenzitás gerjesztés Fluoreszcenciás detektor – FLD

5 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Fluoreszcenciás detektor – FLD

6 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Fluoreszcenciát csökkentő tényezők: Oldott oxigén vagy más szennyező Fluoreszcenciát befolyásoló tényezők

7 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna  A mérendő komponens koncentrációja;  Gerjesztési forrás intenzitása;  Besugárzott minta térfogata (cella térfogat);  A z emittált fényt elnyelő oldószer, vagy oldott anyagok (koelució, szennyezések);  A szórt fény megnöveli a zajt (nagy molekulák, más fényvisszaverő felület) Fluoreszcens detektálást befolyásoló egyéb tényezők

8 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna 225/ / / / / / / /495 Gerjesztési / emissziós hullámhossz  ex / em PAH-ok mérése HPLC-FLD-vel

9 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Olyan vegyületek detektálására alkalmazzuk, amelyek un. „elektroaktív” csoportot tartalmaznak. Ezek a csoportok könnyen: Oxidálódhatók Redukálhatók Szerkezet megvizsgálásával és egy ciklikus voltammogram felvételével tervezhetővé válik. Elektrokémiai (amperometriás) detektor-ECD

10 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna 10 Előnyök: Igen szelektív, igen érzékeny Hátrányok: Fémek jelenléte jelentősen zavarja (Fe, Ni, etc.). Gradiens nem alkalmazható Kis hőmérséklet- és áramlás- ingadozások is zavarják = NEM ROBOSZTUS Elektrokémiai (amperometriás) detektor-ECD

11 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Elektrokémiai (amperometriás) detektor - ECD OxidálhatóRedukálható FenolokKetonok OximokAldehidek MerkaptánokOximok PeroxidokKonjugált savak/észterek/nitrilek HidroperoxidokKonjugált kettőskötés Aromás aminok, diaminok Aktív halogén Purin vázasokAromás halogén Nitrovegyületek

12 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Fő alkalmazási terület: metabolizmus kutatásban Radiokémiai detektor - RD A mérendő komponens rádióaktivitása által kiváltott fény emissziót méri (Heterogén – homogén szcintilláció) Mérhető pl: 35 S, 14 C, 3 H, 131 I

13 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna 1.Porlasztás: Nitrogén gáz segítségével az oszlopot elhagyó eluenst elporlasztjuk. 2.Mozgó fázis elpárologtatása: Egy fűtött csőben áramoltatjuk át, ahol az oldószer elpárolog. 3. Detektálás: A száraz minta részecskéket lézer fénnyel világítjuk meg egy átfolyó cellában. A részecskék által szórt fényt detektáljuk. A detektált fény arányos a részecskék számával (koncentrációjával). Fényszórásos detektor – Evaporative Light Scattering Detector, ELSD

14 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna ELSD

15 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna  Univerzális detektor, de csak akkor alkalmazható, ha az elválasztott komponensek törésmutatója eltér az eluens törésmutatójától;  Gradiens elúcióval nem kompatibilis (0,1% eluens összetétel változás már a törésmutató változását idézheti elő);  Hőmérséklet változás (0,001  C –ra termosztáljuk);  Pumpa pulzálás kontroll !!!!  Off-line eluens keverés Refraktív index (törésmutató) detektor – RID

16 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna RID

17 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna IZOKRATIKUS t R (min) mAU GRADIENS t R (min) mAU Izokratikus ill. gradiens elúció

18 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna A F A F A B C D E F B+C D+E 30% ACN 70% 20mM Foszfát, pH= % ACN 50% 20mM Foszfát, pH= % ACN 20% 20mM Foszfát, pH=6.95 A: Feniletilamin B: Piridin C: 2-Picolin D: 2,4 Lutidin E: 4-ethylpiridin F: 2,3 dimetilanilin A B C D EF Az eluens erősség változása Izokratikus ill. gradiens elúció

19 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Gradiens elúció

20 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Gradiens elúció problémák: Egyensúly beállás idő; Mozgófázis tisztasága („0” –lépésként oldószer ellenőrzése); Retenciós sorrend (szelektivitás) változása; Oldószer probléma (k>10 vs. a minta oldása); Detektor kompatibilitás (pl. RI detektor). Gradiens elúció

21 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Viszkozitás – összetétel összefüggés Kísérleti körülmények: Purosphere C18, 5  m; 125*3mm, 25  C 75% AcN 100% AcN 1 ml/perc 0,56ml/perc Gradiens elúció – nyomás profil

22 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna MIP-Molecularly Imprinted Polimer Célvegyület Monomerek Célvegyület Elrendeződés Polimerizáció (UV vagy T) Célvegyület Extrakció MIP - célvegyület

23 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna MIP-alkalmazás MIP-Molecularly Imprinted Polimer

24 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Alkalmazások: Immunaffinitás kromatográfiával az oszlopon megkötött antitestekkel (antibodies) antigéneket tisztítunk; Receptorok, enzimek, DNS fragmensek izolálására; Ellenanyaggal tisztíthatjuk azt a vegyületet, amely az ellenanyagot termelte; Immobilizált antitestekkel toxinokat kötnek meg vérből (hemoperfúzió); Szilárd fázisú immunoassay alkalmazásokban. Az ipar biotechnológiai alkalmazásokban monoklonális antitestek ipari méretekben történő gyártására. Affinitás kromatográfia

25 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Állófázis (mátrix) 90%-ban agar-agar gél, a többi sephadex gél, cellulóz származékok vagy egyéb polimer.Állófázis (mátrix) 90%-ban agar-agar gél, a többi sephadex gél, cellulóz származékok vagy egyéb polimer távtartó ligandum + Affinitás kromatográfia

26 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna 1. Kondicionálás Puffer Affinitás kromatográfia

27 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Puffer 2. Mintafelvitel és mosás Affinitás kromatográfia

28 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Eluáló szer 2. Eluálás Affinitás kromatográfia

29 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna mintafelvitel Abszorbancia mAU Oszlop térfogat (ot) váltás elúciós pufferre 1-2 ot.x ot.1-2 ot.>1 ot. 1-2 ot. egyensúly Minta megkötődése, egyéb komponensek eluálása Minta eluálása egyensúly Affinitás kromatográfia

30 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna a.Immobilizáljuk a fémet kelát képző ligandumok segítségével; b.Különböző stabilitású komplexek képződnek a fém és olyan proteinek között, amelyek elektron donor csoportot tartalmaznak (pl hisztidin, triptofán, cisztein vagy foszfát csoport). c.A komplex stabilitása függ a ligandum, fém típusától, elektron donor csoport sztérikus hozzáférhetőségétől, hőmérséklettől, pH és kompetitív donor jelenlététől. Alkalmazott pH=6-8. d.Eluálás pH gradienssel vagy a glicin, hisztidin, hisztamin, cisztein koncentrációjának növelésével (N és/vagy S tartalmú vegyületek, amelyek erős elektron donorként leszorítják a proteint a fémről). Immobilizált fém affinitás kromatográfia ( immobilized metal affinity chromatography - IMAC) Affinitás kromatográfia

31 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna A GÉLKROMATOGRÁFIA ELVÁLASZTÁSI MECHANIZMUSÁNAK SZTERIKUS ELMÉLETI MODELLJE Gélkromatográfia

32 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Dalton méretű molekulák méret szerinti elválasztása Dalton méretű molekulák méret szerinti elválasztásaAlkalmazások: Polimerek, polimer adalékok vizsgálata;Polimerek, polimer adalékok vizsgálata; Biopolimerek, peptidek, enzimek elválasztása;Biopolimerek, peptidek, enzimek elválasztása; Molekulatömeg eloszlás, átlag molekulatömeg meghatározás;Molekulatömeg eloszlás, átlag molekulatömeg meghatározás; Minták tisztítása (peszticidek meghatározása élelmiszer mátrixból);Minták tisztítása (peszticidek meghatározása élelmiszer mátrixból); A minta sómentesítése;A minta sómentesítése; Puffer csere.Puffer csere. Gélkromatográfia

33 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Pórusok (dp> 100A  ) Gél szemcse Eltérő méretű molekulákból álló minta Állófázis a kolonnában Nincs kölcsönhatás a minta- molekula és az állófázis között!! Gélkromatográfia

34 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Eltérő méretű molekulákból álló minta Idő (perc) Abs 265nm „Fordított szita” Gélkromatográfia

35 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Teljes kizárási tartomány- az a nagyobb molekulaméret amelynél nincs visszatartás (holt térfogat);Teljes kizárási tartomány- az a nagyobb molekulaméret amelynél nincs visszatartás (holt térfogat); Mérési (működési) tartomány - az a molekulaméret, amelynél van visszatartás;Mérési (működési) tartomány - az a molekulaméret, amelynél van visszatartás; Teljes áteresztési tartomány – nagyon kis molekulák, amelyek teljesen átjárják a pórusokat (a retenciós idő konstans);Teljes áteresztési tartomány – nagyon kis molekulák, amelyek teljesen átjárják a pórusokat (a retenciós idő konstans); Teljes áteresztési tartomány Mérési tartomány Teljes kizárási tartomány lgM V (ml) Gélkromatográfia

36 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Sómentesítés gélkromatográfiával Gélkromatográfia

37 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Antitest tisztaságvizsgálata gélkromatográfiával Gélkromatográfia

38 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna MOLEKULA TÖMEG (MÉRET) MEGHATÁROZÁSA GÉLKROMATOGRÁFIÁVAL Gélkromatográfia

39 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna A MOLEKULA TÖMEGÉNEK ÉS MÉRETÉNEK ÖSSZEFÜGGÉSE A gélkromatográfia alkalmazására vonatkozóan hangsúlyozni kell a molekula tömegének és (virtuális) méretének összefüggését (eltérését), amely a molekula fajlagos parciális térfogatával és a Stokes-féle rádiusszal írható le: M – molekulatömeg, N – Avogadro-féle szám, a – Stokes-féle rádiusz, D – diffuziós állandó, υ – molekula fajlagos parciális térfogata, η – viszkozitási együttható. Gélkromatográfia

40 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Ionpár fordított fázisú folyadékkromatográfia

41 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Ionpárképző reagens (Quaterner alkil ammónium só) N+N+ Ion-párképző só [Molekula ION] - Mérendő komponens ionos formája N+N+ [Molekula ION] - C18 szilárd fázis Ionpár fordított fázisú folyadékkromatográfia

42 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Ionpárképző reagens (Alkil szulfonsav só) [Molekula ION] + Mérendő komponens ionos formája C18 szilárd fázis Ionpárképző só S O O O-O- O S O [Molekula ION] + O-O- Ionpár fordított fázisú folyadékkromatográfia Esetleg: CF 3 COO - ; BF 4 - ; ClO 4 -, PF 6 -

43 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna C18 szilárd fázis [ION] + SO 3 - Na + SO3-SO3- [ION] + SO 3 - Na + Na + Módosított állófázis Ionpárképző mechanizmus (ioncserés modell)

44 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Az RP-IP_HPLC-ben változtatható paraméterek: Ionpárképző koncentrációja;Ionpárképző koncentrációja; Ionpárképző jellege (típusa, lánc hossza, stb.)Ionpárképző jellege (típusa, lánc hossza, stb.) Szerves modifikátor típusa, mennyisége;Szerves modifikátor típusa, mennyisége; Puffer koncentrációja, pH-ja;Puffer koncentrációja, pH-ja; Idegen só koncentrációja;Idegen só koncentrációja; Ionpár fordított fázisú folyadékkromatográfia

45 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Ionpár fordított fázisú folyadékkromatográfia – a szerves fázis hatása

46 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Ionpár fordított fázisú folyadékkromatográfia – ionpárképző típusa

47 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Ionpár fordított fázisú folyadékkromatográfia – ionpárképző típusa

48 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Ioncserés folyadékkromatográfia

49 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna A. Ionkizárásos kromatográfia B. Ionkromatográfia Ioncsere: ha az állófázis állandó töltéssel rendelkezik; Ioncserélő kapacitás: megkötött ellentétes ion mennyiség egységnyi tömegű tölteten (mmol/g vagy mekv./g); „Ioncserélő gyanták” Ioncserés folyadékkromatográfia

50 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna KATION CSERÉLŐK Negatív töltésű funkcionális csoportokkal (szulfonil, karbonil, PO 4 - ) ANION CSERÉLŐK Pozitív töltésű (primer, vagy szubsztituált, szekunder, tercier, kvaterner amino, imino, guanidil, stb.) funkcionális csoportokkal AMFOTER (kevert) TIPUSOK Pozitív és negatív töltésű funkcionális csoportokat tartalmazó komplex szerkezettel ERŐS - GYENGE IONCSERÉLŐK DISSZOCIÁCIÓ FOKA (pK A, pK K, pK I ) SZERINT „TENTACLE” ELV - KAPACITÁS ! Ioncserélő töltetek

51 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna pórus Állófázis: nagy ioncserélő kapacitású anion vagy kation cserélő gyanta; Eluens: puffer (ritkán kis szerves oldószer tartalommal); Alkalmazásai: fermentlevek, szeszesital, üdítőital gyártás (cukrok, savak, alkoholok elválasztása) SO - 3 HOOC-R - OOC-R HO-R Cukor Ionkizárásos folyadékkromatográfia

52 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna A szervetlen anionok, kationok vagy vízben oldódó szerves savak és bázisok meghatározására használjuk Állófázis: Állófázis: kis ioncserélő kapacitású anion vagy kation cserélő gyanta; Eluens: Eluens: puffer; Detektor: Detektor: vezetőképesség (elektrokémiai) ionelnyomó után. Ionkromatográfia

53 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna HordozóTípus Jellemzők Üveggyöngy ioncserélő bevonattal Filmszerű (37-44  m) Gyors elválasztás, közepes hatékonyság, kis kapacitás, pH 2-8, szárazon töltik, könnyen beszennyeződik Szilikagél alapú Mikropórusos (10 nm) Közepes gyorsaság, leghatékonyabb, pH 2-8, pépes töltés PolisztirolMikropórusos (10 nm) Lassú, kis hatékonyságú, jó kapacitás, pH 0-12, pépes töltés Ionkromatográfia

54 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Növekvő pH Nő a savak ionizációja – nő a visszatartás; Csökken a bázikus vegyületek ionizációja – gyorsan eluálódnak; Puffer erősség nő Ioncserélő felületeken megnő a versengés – csökken a retenció; Nő a hőmérséklet Egyensúly kedvez a mozgó fázisnak – csökken a retenció. Visszatartást befolyásoló tényezők: Ionkromatográfia

55 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Ionkromatográfia

56 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Vezetőképesség mS Idő (min) Szupresszió előtt Szupresszió után Ionkromatográfia

57 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Az ionelnyomóban lejátszódó folyamatok (eluens NaHCO 3 ): Gyanta-H + + Na + HCO 3 --> Gyanta-Na + + H 2 CO 3 Gyanta-H + + Na + Cl - --> Gyanta-Na + + HCl A mozgófázis vezetőképessége jelentősen csökken, az elválasztott ion vezetőképessége a Na ion (50 S*Cm 2 /equiv.) H ionnal (350 S*cm 2 /equiv.) történő cseréjével jelentősen megnő. Cl - meghatározása Szupresszió ioncserés oszloppal (Regenerálni kell!!) cél: a mozgófázis vezetőképességének csökkentése (S/N növelése) Az ionelnyomóban lejátszódó folyamatok (eluens HCl): Gyanta-OH - + H + Cl - --> Gyanta-Cl - + H 2 O Gyanta-OH - + Na + Cl - --> Gyanta-Cl - + Na + OH - A mozgófázisból víz lesz, a mintában pedig lecseréljük a Cl - (76 S*cm 2 /equiv) ionokat OH - ionokra (198 S*cm 2 /equiv). Na + meghatározása Ionkromatográfia

58 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Alkalmazás (Anion referencia oldat); 0,5M Na 2 CO 3 és NaHCO 3 IonPac® AS14; 4*250mm oszlop és IonPac® AG14; 4*50mm előtétoszlop Ionkromatográfia

59 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Alkalmazás (vízminta); 0,5M Na 2 CO 3 és NaHCO 3 IonPac® AS14; 4*250mm oszlop és IonPac® AG14; 4*50mm előtétoszlop Ionkromatográfia

60 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Ionkromatográfia

61 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna 21 TERMÉSZETES AMINOSAV IONCSERÉLŐ KROMATOGRÁFIÁS ELVÁLASZTÁSA Dionex DC-6A ANIONCSERÉLŐN (30X0,46 cm) 3 LÉPÉSES Na-citrát gradiens DETEKTÁLÁS: NINHIDRIN (post-column) Ionkromatográfia

62 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Hidrofób kölcsönhatású kromatográfia (Hidrophobic Interaction Chromatography, HIC)

63 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Hidrofób kölcsönhatású kromatográfia

64 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Mindkét technikában közös és jellemző: - Az álló fázis a hordozóra kötött apoláris ligandum. - A szorpció oka a hidrofób (apolárIs) kölcsönhatás. - A retenciót döntő módon a hidrofóbicitási viszonyok határozzák meg. - Alkalmasak fehérjék elválasztására. HIC vs. RPC

65 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna KÜLÖNBSÉGEK: - A HIC liganduma gyengébben apoláris, kisebb a felületi koncentrációja. -A HIC esetén sokkal gyengébb a szorpció, a fehérje natív formában (folded) marad, kisebb a denaturáció esélye. -A RPC esetében az erős szorpció megszüntetheti az eredeti struktúrát (unfolding), itt a retenciót elsősorban az elsődleges szerkezet hidrofób jellege határozza meg. - A RPC esetében a fehérje spontán kötődik a ligandumhoz. Az elúciót szerves oldószer adagolása okozza. A HIC esetében a fehérje kötődése a tölteten és a retenció mértéke a kozmotróp só adagolásával érhető el. Az elúció a só negatív koncentráció gradiensének eredménye. -A RPC esetében a hidrofób kölcsönhatásért döntően az álló fázis (ligandum) felelős, a HIC esetében az áramló fázis (eluens) a domináns tényező HIC vs. RPC

66 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Hidrofil kölcsönhatású folyadékkromatográfia (Hidrophilic Interaction Liquid Chromatography; HILIC)

67 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna HILIC Állófázis: mint a normál fázisú kromatográfiában Eluens: mint a fordított fázisú kromatográfiában 3-40% vízzel (A víz az erős oldószer !!!) Alkalmazásai: RP-hez túl poláros, nehezen visszatartható komponensek elválasztására

68 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna HILIC példa 1. Fucose

69 Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna HILIC példa 2.


Letölteni ppt "Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Elválasztástechnikai Kutató és Oktató Laboratórium Elválasztástechnika kv1n1lv1."

Hasonló előadás


Google Hirdetések