Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

NAGYHATÉKONYSÁGÚ FOLYADÉKKROMA- TOGRÁFIA = NAGYNYOMÁSÚ = HPLC Az alkalmazott nagy nyomás (100-1000 bar) lehetővé teszi nagyon finom szemcsézetű töltetek.

Hasonló előadás


Az előadások a következő témára: "NAGYHATÉKONYSÁGÚ FOLYADÉKKROMA- TOGRÁFIA = NAGYNYOMÁSÚ = HPLC Az alkalmazott nagy nyomás (100-1000 bar) lehetővé teszi nagyon finom szemcsézetű töltetek."— Előadás másolata:

1 NAGYHATÉKONYSÁGÚ FOLYADÉKKROMA- TOGRÁFIA = NAGYNYOMÁSÚ = HPLC Az alkalmazott nagy nyomás ( bar) lehetővé teszi nagyon finom szemcsézetű töltetek (2-10 μm) használatát, ami jelentősen megnöveli a módszer felbontóképességét. Az alkalmazott nagy nyomás ( bar) lehetővé teszi nagyon finom szemcsézetű töltetek (2-10 μm) használatát, ami jelentősen megnöveli a módszer felbontóképességét. A hagyományos oszloptechnikánál gyorsabb (kényszer áramlás), pontosabb és folyamatosan detektálható. A hagyományos oszloptechnikánál gyorsabb (kényszer áramlás), pontosabb és folyamatosan detektálható. A gázkromatográfiával szemben hőre érzékeny- és nem illó vegyületek esetében is használható. A gázkromatográfiával szemben hőre érzékeny- és nem illó vegyületek esetében is használható. A mozgófázissal szelektív kölcsönhatások alakulnak ki. A mozgófázissal szelektív kölcsönhatások alakulnak ki.

2 HPLC FELÉPÍTÉSE

3 Ő építette meg az első nagynyomású folyadékkromatográfot. Bár a szakirodalmi adatok szerint J. C. Giddings, Joseph F. K. Huber és Horváth Csaba egyaránt jelentős szerepet vállaltak - egymástól függetlenül - a HPLC kifejlesz- tésében és elterjesztésében, a HPLC atyjának mégis egyértelműen Hor- váth Csaba professzort ismeri el a szakma, mivel elsőként ő ismerte fel a HPLC egyedülálló jelentőségét a biokémia, a molekuláris biológia és a modern bioanalitika területein. A legelismertebb, az RP-HPLC-t meg- alapozó elméleti közleményére csak- nem ezer citálást kapott, ez az elvá- lasztástudomány legtöbbször idézett munkája. Bár a szakirodalmi adatok szerint J. C. Giddings, Joseph F. K. Huber és Horváth Csaba egyaránt jelentős szerepet vállaltak - egymástól függetlenül - a HPLC kifejlesz- tésében és elterjesztésében, a HPLC atyjának mégis egyértelműen Hor- váth Csaba professzort ismeri el a szakma, mivel elsőként ő ismerte fel a HPLC egyedülálló jelentőségét a biokémia, a molekuláris biológia és a modern bioanalitika területein. A legelismertebb, az RP-HPLC-t meg- alapozó elméleti közleményére csak- nem ezer citálást kapott, ez az elvá- lasztástudomány legtöbbször idézett munkája. Horváth Csaba

4 OLDÓSZEREK Üveg, vagy műanyag edények. Üveg, vagy műanyag edények. Megfelelő tisztaság (oszlop védelme és a megfelelő detektálás érdekében!). Megfelelő tisztaság (oszlop védelme és a megfelelő detektálás érdekében!). Gázmentes. Eluensben oldott gázok és főleg az O 2 eltá- volítása. Zavarja a pumpa egyenletes működését és a detektorban kis csúcsokat produkál. Gázmentes. Eluensben oldott gázok és főleg az O 2 eltá- volítása. Zavarja a pumpa egyenletes működését és a detektorban kis csúcsokat produkál. Gázmentesítés megvalósítása: Gázmentesítés megvalósítása: - melegítés; - melegítés; - vákuum alkalmazása; - vákuum alkalmazása; - ultrahangos szonikálás (rázatás); - ultrahangos szonikálás (rázatás); - sparge = He gáz átbuborékoltatása folyamatosan (oldott gázokat kiűzi). - sparge = He gáz átbuborékoltatása folyamatosan (oldott gázokat kiűzi). Szűrés – üvegszűrő + vákuum alkalmazása. Szűrés – üvegszűrő + vákuum alkalmazása.

5 SZIVATTYÚK Feladatuk: egyenletes, szabályozott folyadékáramlás Feladatuk: egyenletes, szabályozott folyadékáramlás Mechanikus szivattyúk – állandó áramlási sebesség biztosítása. Két egymással szemben működtetett váltakozó mozgásirányú dugattyús szivattyúk (reciprok pumpák). Mechanikus szivattyúk – állandó áramlási sebesség biztosítása. Két egymással szemben működtetett váltakozó mozgásirányú dugattyús szivattyúk (reciprok pumpák). Pulzáláscsillapító Pulzáláscsillapító

6

7 Pulzáláscsillapító 1, tekercs - flexibilis 2, membrán – hexánnal töltve 1 2

8 Szivattyú után nagynyomású szűrő következik (2 μm- es saválló acél). Szivattyú után nagynyomású szűrő következik (2 μm- es saválló acél). Nyomásmérő (jelzi, ha az oszlop eltömődik, vagy a szivattyú hibás). Nyomásmérő (jelzi, ha az oszlop eltömődik, vagy a szivattyú hibás). Összekötő csövek: saválló acél, vagy speciális műanyag 0,2-0,3 mm belső átmérővel. Minél rövidebb utak → kis holttérfogat (keverőedény effektus). Összekötő csövek: saválló acél, vagy speciális műanyag 0,2-0,3 mm belső átmérővel. Minél rövidebb utak → kis holttérfogat (keverőedény effektus). GRADIENSKÉPZŐ GRADIENSKÉPZŐ 1. Izokratikus elúció – változatlan összetételű mozgófázis 2. Gradiens elúció – az eluens összetételének folyamatos (lineáris, exponenciális, vagy parabolikus), vagy ugrás- szerű változtatása. Alacsony nyomású keverő – pumpa előtti keverés Alacsony nyomású keverő – pumpa előtti keverés Nagy nyomású keverő – pumpa után, oszlop előtti keverés Nagy nyomású keverő – pumpa után, oszlop előtti keverés

9

10 Mintainjektáló rendszer Injektált mennyiség (analitikai): μl Injektált mennyiség (analitikai): μl Fajtái: Fajtái: 1. Injektálószelep - Rheodyne, cserélhető rögzített térfogatú hurkokkal (loop). 2. Automata mintaadagoló Programozható mintamennyiség – motorizált fecskendő. Programozható mintamennyiség – motorizált fecskendő. Automatizált mérés (100 mérés/éjszaka). Automatizált mérés (100 mérés/éjszaka).

11 Kézi injektálás

12 Automata mintaadagoló

13 OSZLOP Anyaga: saválló acél, vagy műanyag. Anyaga: saválló acél, vagy műanyag. 10 – 30 cm hosszú, d = 2-6 mm. 10 – 30 cm hosszú, d = 2-6 mm. Analitikai oszlop védelmének érdekében előtét oszlopot használunk (védő oszlop = guard column), mely azonos töltetű, mint az analitikai oszlop (1-5 cm). Analitikai oszlop védelmének érdekében előtét oszlopot használunk (védő oszlop = guard column), mely azonos töltetű, mint az analitikai oszlop (1-5 cm). Töltetek szemcsemérete 2-10 μm, nagy fajlagos felület > 100 m 2 /g, nagy kapacitás és kellő szilárdság. Töltetek szemcsemérete 2-10 μm, nagy fajlagos felület > 100 m 2 /g, nagy kapacitás és kellő szilárdság. Hatékonyan elválasztó oszlopot csak egyenletes kisátmé- rőjű, gömb alakú szemcsékből lehet készíteni. Hatékonyan elválasztó oszlopot csak egyenletes kisátmé- rőjű, gömb alakú szemcsékből lehet készíteni. Minél kisebb a szemcseméret, annál nagyobb N (nagyobb a fajlagos felület), csökkentésének határt szab a növekvő nyomás, amit a megnövekedett oszlopellenállás produkál (sugárirányú hőmérséklet gradiens). Minél kisebb a szemcseméret, annál nagyobb N (nagyobb a fajlagos felület), csökkentésének határt szab a növekvő nyomás, amit a megnövekedett oszlopellenállás produkál (sugárirányú hőmérséklet gradiens).

14

15 van Deemter görbék különböző szemcseméretű állófázisok esetén Áramlási sebesség ml/min

16 NORMÁL FÁZISÚ FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA Állófázis: poláris, mechanikailag stabil. Állófázis: poláris, mechanikailag stabil. 1. Szilikagél 2. Aluminium-oxid 3. Módosított szilikagél. Porózus anyagok. Szilikagélek átlagos pórus átmérője 6-20 nm (pl. 120 Å), ez red része a szemcseméretnek. Víz dezaktiválja a felületet. Fémszennyezések kerülése.

17 Módosítot szilikagél Módosítot szilikagél Szabad szilanol csoport (gyenge sav) Szubsztituált klórszilánnal módosítják. Felvitt csoportok: fenil, amino, diol, ciano. Poláris (dipol-dipol, dipol-indukált dipol) kölcsönhatás a vegyületek és az állófázis poláris csoportjai között (-OH, -NH 2, -CN), ami retencióhoz vezet. Minél polárisabb egy vegyület, annál tovább tartózkodik az állófázisban, annál nagyobb retenciós ideje lesz.

18 Módosítot szilikagél

19 Mozgófázis Apolárisabb, mint az állófázis (lsd. Eluotróp sorok). Oldószererősség. Minél apolárisabb egy oldószer annál kisebb az oldószererőssége, vagyis a visszatartás (retenciós idő) nagy. Általában szénhidrogének alkotják a mozgófá- zist, ehhez adunk 0,1-20 V/V% poláris oldószert, módosítót (pl. éter, észter, alkohol). Apolárisabb, mint az állófázis (lsd. Eluotróp sorok). Oldószererősség. Minél apolárisabb egy oldószer annál kisebb az oldószererőssége, vagyis a visszatartás (retenciós idő) nagy. Általában szénhidrogének alkotják a mozgófá- zist, ehhez adunk 0,1-20 V/V% poláris oldószert, módosítót (pl. éter, észter, alkohol). Oszlop nyomása Δp = Lμηφ d p 2 d p 2 L = oszlop hossza μ = áramlási sebesség η = viszkozítás φ = az oszlop porozitására jellemző tag d p = átlagos szemcseméret

20 ALKALMAZÁSA Apoláris, vagy közepesen poláris izomer vegyületek elválasztása (szénhidrogénekben jól oldódjanak). Apoláris, vagy közepesen poláris izomer vegyületek elválasztása (szénhidrogénekben jól oldódjanak). Sztereoizomerek elválasztása – királis állófázissal Sztereoizomerek elválasztása – királis állófázissal Félpreparatív elválasztás – szerkezetazonosításra (hosszabb és nagyobb átmérőjű oszlopok) Félpreparatív elválasztás – szerkezetazonosításra (hosszabb és nagyobb átmérőjű oszlopok)

21

22 FORDÍTOTT FÁZISÚ FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA Mozgófázis polárisabb, mint az állófázis Mozgófázis polárisabb, mint az állófázis 1)Módosított szilikagél 2)Szerves polimer alapú állófázisok 3)Szén alapú állófázisok

23 C 18 H 37 Si CH 3 Si OHOH CH 3 C 18 H 37 OH Si CH 3 Si O CH 3 OH Cl + -HCl Savas hidrolízis helye Szabad szilanol csoport Szilikagélt aklilcsoportokat tartalmazó klórszilánnal reagáltatjuk (mono-, di- és triklór-szilánnal).

24 Monofunkciós- és bifunkciós (pl. diklór- szilánnal) módosítás monomer polimer

25 A módosítás során a szilanolcsoportok 40-60%-a reagálat- lan marad. A módosítás során a szilanolcsoportok 40-60%-a reagálat- lan marad. Utóreakció során trimetil-klórszilánnal módosítanak. Endcapping = utóreakció (e) Utóreakció során trimetil-klórszilánnal módosítanak. Endcapping = utóreakció (e) Használhatóság pH tartománya: 2 (alkil csoportok savas hidrolízise) < pH < 8-9 (szilikagél kioldódása). Használhatóság pH tartománya: 2 (alkil csoportok savas hidrolízise) < pH < 8-9 (szilikagél kioldódása). Újfajta oszlopok: pH = Apoláris (diszperziós) kölcsönhatás a vegyületek és az állófázis apoláris csoportjai között (C4, C8, C18), ami retencióhoz vezet. Apoláris (diszperziós) kölcsönhatás a vegyületek és az állófázis apoláris csoportjai között (C4, C8, C18), ami retencióhoz vezet. Minél apolárisabb egy vegyület, annál tovább tartózkodik az állófázisban, annál nagyobb retenciós ideje lesz. Minél apolárisabb egy vegyület, annál tovább tartózkodik az állófázisban, annál nagyobb retenciós ideje lesz.

26 Oszlophossz (cm) Részecskeméret (μm) Tányérszám

27 Mozgófázis Poláris, kis viszkozitású, jó UV áteresztőképességű, kevéssé illékony és toxikus oldószerek. Poláris, kis viszkozitású, jó UV áteresztőképességű, kevéssé illékony és toxikus oldószerek. Víz oldószer erőssége a legkisebb, alkalmazott szerves módosítok, melyek a retenciót csökkentik: metanol

28 Oldószer Oldószer erősség (ε) NORMÁL! Viszkozitás (cP) UV cut-off (nm) Hexán00,33200 Széntetraklorid0,140,97263 Kloroform0,310,57245 Diklórmetán0,320,44235 Tetrahidrofurán0,350,55215 Dietil-éter0,290,23215 Etilacetát0,450,45260 Dioxán0,491,54215 Acetonitril0,500, propanol0,632,3210 Metanol0,730,60205 Víz>1,001- Funkciós csoportok polaritása: C-H < C-O-C < C-N-C < C  N < C=O < HO-C=O < OH

29 Izokratikus elválasztásnál a 4 oldószer módszere

30 Gradiens elució A módszer előnyei: Az analízis ideje lecsökken. Az analízis ideje lecsökken. A felbontóképesség javul. A felbontóképesség javul. Keskenyebb csúcsok. Keskenyebb csúcsok. Nagyobb érzékenység. Nagyobb érzékenység. Gradiens elució Izokratikus elució

31 Gradiens programozás

32

33 Szerves módosítok hatása fordított fázisú kromatográfiás rendszerekben Termodinamikai leírása az adszorpciós jelenségeknek V R = vizsgált komponens retenciós térfogata V 0 = holt térfogat  G an. = vizsgált komponens adszorpciós energiája x = szerves módosító moltörtje  G el. = eluens adszorpciós energiája (~ oldószererősség) Ha x nő →V r csökken Víz nem vesz részt az adszorpcióban, csak a szerves módosító. A komponensek és a módosító vetélkednek az adszorpciós helyekért. Kiszorításos modell.

34 Retenciós térfogat / ml Acetonitril v/v%-a vízben Hidrofób rendszereknél!

35 Alkil-benzolok, alkil-fenonok és alkil-parabének visszatartás változása a szénatomszám függvényében Szénatom szám

36 A pH szerepe az elválasztásban 1) Semleges vegyületek – nincs pH hatás Szénhidrogének, aromás szénhidrogének (PAH), halogénezett aromások (PCB), alkoholok, éterek, ketonok, aldehidek. Szénhidrogének, aromás szénhidrogének (PAH), halogénezett aromások (PCB), alkoholok, éterek, ketonok, aldehidek. 2) Savak és bázisok – pH változás hatására ionizálodnak 3) Ionos vegyületek – pH és puffer hatása 2. és 3. esetben a megoldás: 1)pH kontroll → szupresszió, ionos állapot visszaszorítása. 2)Ionpárképzés 3)Ioncsere kromatográfia

37 Savas csoportot tartalmazó szerves vegyületek visszatartás változása a pH függvényében RCOOH RCOO - /RCOOH RCOO - pKa

38 A pH és módosító hatása savas vegyület elválasztására tailing

39 Bázikus csoportot tartalmazó szerves vegyületek visszatartás változása a pH függvényében R-NH 3 + R-NH 3 + /R-NH 2 pKb R-NH 2

40 A pH hatása bázikus vegyületek elválasztására Bázikus antihisztaminok pH=11 !!!)

41 Fordított fázisú ionpár-kromatográfia (RP-IP-HPLC) A retenció növelése érdekében az eluensbe mmol/L ionpárképző, hidrofób iont teszünk (felületaktív anyagok), melynek töltése ellentétes a meghatározandó anyagéval. A retenció növelése érdekében az eluensbe mmol/L ionpárképző, hidrofób iont teszünk (felületaktív anyagok), melynek töltése ellentétes a meghatározandó anyagéval. Anionos ionpárképző Kationos ionpárképző Alkil-szulfonsavak Tetrabutil-ammónium sók D- és L- kámfor szulfonát Cetil-trimetil-ammónium sók Alkil-szulfátok Dodecil-oktil-dimetil- ammónium sók

42 Kationos ionpárképző és az állófázis elhelyezkedése C18 állófázis N+N+ [Molekula ION] -

43 Az RP-IP-HPLC-ben fontos paraméterek Ionpárképző koncentrációja (c nő → k nő). Ionpárképző koncentrációja (c nő → k nő). Ionpárképző jellege (lánc hossz nő → k nő, egyenes lánc – elágazó lánc). Ionpárképző jellege (lánc hossz nő → k nő, egyenes lánc – elágazó lánc). Szerves módosító típusa és mennyisége. Szerves módosító típusa és mennyisége. Puffer koncentrációja, pH-ja (ionos állapot biztosítása). Puffer koncentrációja, pH-ja (ionos állapot biztosítása). Idegen só koncentrációja. Idegen só koncentrációja.

44 A hőmérséklet hatása az elválasztásra H = 2 λdp + 2γD m + 8 k d f 2 u u π 2 (1+k) 2 D s u π 2 (1+k) 2 D s

45 DETEKTOROK A detektor feladata a kiáramló eluensben mérni az összetevő pillanatnyi koncentrációját. A közvetlenül mért detektorjel általában nem maga a koncentráció, hanem annak valamilyen függvénye. A detektor feladata a kiáramló eluensben mérni az összetevő pillanatnyi koncentrációját. A közvetlenül mért detektorjel általában nem maga a koncentráció, hanem annak valamilyen függvénye. Detektor típusok Detektor típusok Ultraibolya/ látható fény (UV/VIS), LOD: ~ g Ultraibolya/ látható fény (UV/VIS), LOD: ~ g Fluoreszcenciás, LOD: g Fluoreszcenciás, LOD: g Vezetőképességi, LOD: g Vezetőképességi, LOD: g Törésmutató különbség mérése (RI), LOD: g Törésmutató különbség mérése (RI), LOD: g Fényszórásmérésen alapuló (ELS), LOD: g Fényszórásmérésen alapuló (ELS), LOD: g Tömegszelektív (LC/MS), LOD: Tömegszelektív (LC/MS), LOD:

46 Detektorok tulajdonságai Alacsony zajszint és stabil alapvonal (low drift). Alacsony zajszint és stabil alapvonal (low drift). Megfelelő érzékenység. Megfelelő érzékenység. Gyors jelképzés (12 pont/csúcs). Gyors jelképzés (12 pont/csúcs). Széles linearitási tartomány. Széles linearitási tartomány. Alacsony holttérfogat (csúcsszélesedés minimalizálása). Alacsony holttérfogat (csúcsszélesedés minimalizálása). Könnyen kezelhető és megbízható. Könnyen kezelhető és megbízható. Működési körülmények optimalizálhatósága. Működési körülmények optimalizálhatósága.

47 Az elektronpályák relatív energiái és az elektrongerjesztések típusai

48 Spektrofotometriás detektorok Ezek az eluátum fényelnyelését mérik. Az ultraibolya, eset- leg az ultraibolya és a látható fény tartományban működnek. Lambert- Beer törvény: A = lg (I o /I) = ε×c×l Io = a megvilágító fény intenzítása I = fényintenzítás az abszorpció után c = koncentráció ε = abszorpciós együttható l = optikai úthossz

49 Spektrofotometriás detektorok típusai 1, Higanygőzlámpa, 254 nm, monokromatikus fény, (aromás rendszerek).

50 Átfolyó cella UV/VIS detektálásnál

51 Funkciós csoportok moláris abszorbciós koefficiense Név Kromofor csoport Hullámhossz [nm] e Aldehid-CHO2101,500 Amin -NH ,800 Azo-N=N Bromid-Br Karboxil-COOH Diszulfid-S-S-1945,500 Észter-COOR20550 Éter-O-1851,000 Keton>C=O1951,000 Nitrát -ONO Nitril-C=N160- Nitrit-ONO nitro -NO

52 Több csatornás Több csatornás a, diszperziós – diszperziós ráccsal mono- kromatikus fény előállítása a cella előtt. benzol

53 b, diódasoros (PDA) – széleskörben elterjedt. A diódasoros detektorok lehetővé teszik a teljes spektrum felvételét igen gyors egymásutánban. Ezekben a küvettát polikromatikus fénnyel világítják át és a felbontás a küvetta után történik. A szétterült fénnyalábot egy (fotó)-diódasorra vetítik. A 200 nm széles analitikai UV tartomány befogadásához diódából álló sor szükséges (felbontás 1-2 nm). A diódasoros detektor segít a csúcsok azonosításában és tisztaságuk ellenőrzésében, mert koelució esetén a csúcs lefutása közben a spektrum alakja változik, míg egyetlen anyag csúcsa esetén a spektrum alakja állandó, csak a magassága változik.

54 PDA detektor Deutérium lámpa tükör erősítő fotódiódasor Optikai rács Átfolyó cella

55 A és B vegyületek UV spektruma és két eltérő hullámhosszon felvett kromatogramja. A λ1 = állandó viszonyszám A λ1 = állandó viszonyszám A λ2 Csúcstisztaság jellemzése.

56 A klórtalidon gyógyszer tisztaság vizsgálata

57 5 % terc-butil-benzol szennyezés kimutatása antracénban A 250/A 255 antracén

58 Csúcstisztaság vizsgálat PDA detektorral a b

59 Fluoreszcenciás detektor Szelektív, mert a szokványos szerves vegyületek közül viszonylag kevés mutat számottevő fluoreszcenciát. Szelektív, mert a szokványos szerves vegyületek közül viszonylag kevés mutat számottevő fluoreszcenciát. Kettős „hangolás” : változtatni lehet a besugárzó fény (UV tartományban) - és a kisugárzott, fluoreszcens, fény hullámhosszát (UV/látható tartományban). Kettős „hangolás” : változtatni lehet a besugárzó fény (UV tartományban) - és a kisugárzott, fluoreszcens, fény hullámhosszát (UV/látható tartományban). Gerjesztési spektrum (excitation) Gerjesztési spektrum (excitation) Emissziós spektrum (emission) nyerhető. Emissziós spektrum (emission) nyerhető.

60 Az átfolyó küvettát itt is egy szűk fénynyalábbal világítják meg és a beeső fényre merőleges irányból történik a detektálás. A detektált fény intenzitása a fluoreszkáló komponens koncentrációjá- val egyenesen arányos. Ez a detektor nagyságrendekkel kisebb koncentrációk mérésére alkalmas, mint az UV detektor ( g/anyag). Az átfolyó küvettát itt is egy szűk fénynyalábbal világítják meg és a beeső fényre merőleges irányból történik a detektálás. A detektált fény intenzitása a fluoreszkáló komponens koncentrációjá- val egyenesen arányos. Ez a detektor nagyságrendekkel kisebb koncentrációk mérésére alkalmas, mint az UV detektor ( g/anyag).

61 Gerjesztési hullámhossz

62 3D fluoreszcenciás spektruma a Balti tengeri kőolajnak

63 Fluoreszcenciás detektor felépítése

64 AlKALMAZÁS AlKALMAZÁS Természetesen fluoreszkáló vegyületek (merev szerkezetű aromás vegyületek, porfin vázas vegyületek, riboflavinok, vitaminok, gyógyszerek). Természetesen fluoreszkáló vegyületek (merev szerkezetű aromás vegyületek, porfin vázas vegyületek, riboflavinok, vitaminok, gyógyszerek). Származékkészítési reakciók alkalmazása fluoreszkáló vegyületek előállítására (OPA + tiol, FMOC, Fluoreszkamin, stb.). Származékkészítési reakciók alkalmazása fluoreszkáló vegyületek előállítására (OPA + tiol, FMOC, Fluoreszkamin, stb.). OPA + tiol FMOC

65

66 Idő (s) λex λem nm 340 nm nm 320 nm nm 385 nm nm 420 nm nm 380 nm nm 430 nm

67 Vezetőképességi detektor Elektromos vezetést mérő (konduktometriás) de- tektor. Elektromos vezetést mérő (konduktometriás) de- tektor. HPLC detektálásra elsősorban az ionkromatog- ráfiában jön szóba. HPLC detektálásra elsősorban az ionkromatog- ráfiában jön szóba. Konduktometriásan jól lehet mérni az eluátum- ban, mert könnyű kis térfogatú mérőcellát építeni, a műszer egyszerű, a jel a mérendő koncentráci- óval egyenesen arányos és a detektor csak az ionos összetevőket méri. Konduktometriásan jól lehet mérni az eluátum- ban, mert könnyű kis térfogatú mérőcellát építeni, a műszer egyszerű, a jel a mérendő koncentráci- óval egyenesen arányos és a detektor csak az ionos összetevőket méri.

68 Refraktív index (törésmutató) detektor o Univerzális detektor, de csak akkor alkalmazható, ha az elválasztott komponensek törésmutatója eltér az eluens törésmutatójától. o Gradiens elúcióval nem kompatibilis (0,1% eluens összetétel változás már a törésmutató változását idézheti elő). o Hőmérséklet változás (0,001  C –ra termosztáljuk). o Pumpa pulzálás kontroll.

69

70 Fényszórás detektor ELS (evaporative light scattering detector) 1.Porlasztás: Nitrogén gáz segítségével az oszlopot elhagyó eluenst elporlasztjuk. 2.Mozgó fázis elpárologtatása: Egy fűtött csőben áramoltatjuk át, ahol az oldószer elpárolog. 3.Detektálás: A száraz minta részecskéket lézer fénnyel világítjuk meg egy átfolyó cellában. A részecskék által szórt fényt detektáljuk. A detektált fény arányos a részecskék számával (koncentrációjával). Univerzális, tömeg detektor.

71

72

73 ELS detektor alkalmazása -Lipidek - zsírsavak - cukrok - tenzidek - polimerek - aminosavak

74 Az ACQUITY UPLC oszlopok Bridged Ethyl Hybrid (BEH) töltete

75 Fájdalomcsillapítók gyors elválasztása Oszlop: ACQUITY UPLC BEH 2,1x50 mm, 1,7 µm, 1ml/min Komponensek: 1. acetaminofen, 2. 2-acetamidofenol, 3. koffein, 4. acetanilid, 5. acetil-szalicilsav, 6. szalicilsav, 7. fenacetin

76

77


Letölteni ppt "NAGYHATÉKONYSÁGÚ FOLYADÉKKROMA- TOGRÁFIA = NAGYNYOMÁSÚ = HPLC Az alkalmazott nagy nyomás (100-1000 bar) lehetővé teszi nagyon finom szemcsézetű töltetek."

Hasonló előadás


Google Hirdetések