Megtermékenyítés, barázdálódás és a hólyagcsíra kialakulása Dr. Csáki Ágnes Humánmorfológiai és Fejlődésbiológiai Intézet 2015

Az ejakuláció során 40-400 millió spermium kerül a hátsó hüvelyboltozatba (fornix vaginae posterius). Néhány száz-1500 éri el közülük a petesejtet. A hátsó hüvelyboltozatból a spermiumok részben passzívan (spermiumtranszport), részben aktívan (a spermiumfarok csillómozgása révén) jutnak el a méh nyakcsatornáján (cervix uteri), a méh üregén (uterus) keresztül a petevezető kezdeti szűk szakaszába (isthmus tubae uterinae), majd innen a petevezető kitágult részébe (Ampulla tubae uterinae). Itt történik majd a megtermékenyítés. A spermiumok ejakuláció után kb. 5 napig életképesek, illetve 3 napig megtermékenyítésre képesek a női nemi utakban.

A megtermékenyítés fontosabb eseményei időrendi sorrendben: 1. a spermiumok kapacitációja, transzportja és kemotaxisa; 2. a zona pellucida felismerése: az első felismerés, és kötődés a spermium részéről; 3. akroszómareakció (AR); 4. a második felismerés: a gaméták fúziója; 5.a polispermia megakadályozása 6. a sejtmagok egyesülése, a petesejt anyagcseréjének megváltozása és az első mitózis - barázdálódás

1. Kapacitáció Az ejakulátumban háromféle spermium található. Az elsőbe tartozók túl öregek a megtermékenyítéshez. A másodikba tartozók megtermékenyítésre képesek (ezek aránya mindig 10-12%), míg a harmadikba tartozók még túl fiatalok, akiknek a női nemi utakban még érniük kell. Ezt az utóérést nevezzük kapacitációnak. Időtartama 50-240 perc. Az ejakulált spermiumok folyamatosan érnek, illetve öregednek el, így a kb. 10%-nyi kapacitált populáció (egyedi összetétele) folyamatosan változik. A kapacitáció során megváltozik a plazmamembrán összetétele: fluidabb lesz, mert csökken a koleszterol tartalma, számos fehérjéje foszforilálódik, a spermiumok mozgékonysága növekszik Csak a kapacitáción átesett spermiumok képesek a következő lépés megtételére.

A spermiumok transzportja és kemotaxisa Transzport: A spermiumok a méhen keresztül a tuba isthmusába ezen szervek simaizom működése révén jutnak el (a csillómozgás csak a szuszpenzióban tartáshoz kell). A mai elképzelések szerint az isthmus valamiféle spermium-raktár (várakozási hely) lenne, ahonnan a kapacitált spermiumok (és csak ezek) csak az ovulációt követően, a tüszőfolyadékból kiszabadult kemoattraktánsok hatására jut el a petesejt közelébe Kemotaxis: A spermiumok saját mozgását kémiai grádiensek irányítják. A 60-es években kimutatták, hogy az emlősökben a tüszőfolyadék vonzza a spermiumokat. Ezt követően több kemoattraktív komponensét sikerült azonosítani, mint pl. a progeszteront, vagy az atriális natriuretikus faktort Ez a kemotaktikus hatás csak a kapacitált spermiumokon érvényesül.

„ a nagy találkozás előtt” Második akadály: Zona pellucida -glikoprotein mátrix -a növekvő oocyta termeli -biztosítja a faj-specifikus kapcsolódást -megakadályozza a polispermiát Akadályok…. Első akadály: -granulosa sejtek rétege (corona radiata) hialuronsavas mátrixba ágyazódva -spermiumok plazma membránja tartalmaz egy proteint, amely képes oldani a hialuronsavas réteget

A zona pellucida fehérjéi: ZP1 (200 kDa) ZP2 (120 kDa) ZP3 (83 kDa, ebből csak 44 kDa a polipeptidváz, a többi a piros „dobverőként” illusztrált oligoszaccharid oldallácok)

2. Az első felismerés a spermiumok a zona pellucidát ismerik fel. A ZP3-at ismerik fel a spermium feji membránjában lévő zona receptorok. A ZP3 erősen glikozilált Galaktoziltranszferáz a spermium feji membránján ZP3-GalT kapcsolódás→G-protein aktiválás→ Ca+ csatorna nyitás→acrosómális reakció

3. Akroszómareakció (AR) A spermiumfej TEM felvételen (nehogy valaki megtanulja!!!):: n: sejtmag oam: külső akroszomális membrán iam: belső akroszomális membrán pm: sejtmembrán es: ekvatoriális szegmens pas: posztakroszomális szegmens Az akroszómareakció mechanizmusa A külső acrosoma membrán + spermium plazmamembránja számos helyen összeolvad 2. A két membrán kis vesiculák láncolatára darabolódik (matrix anyag kapcsolja össze) 3. Nagymennyiségű Ca++ lép be a spermium fej plazma membránján keresztül 4. Az acrosomaban tárolt enzimek kiszabadulnak a leváló vesiculált membrán alól (esterases, acrosin (nem diffuzibilis!!), és neuraminidase) 5. Enzimek alagutat emésztenek a zona pellucidaban

Az AR reakció során az akroszómatartalom kiürül Az AR reakció során az akroszómatartalom kiürül. Az így kiszabaduló enzimek segítségével a spermium egy csatornát „fúr” a zonába, amelyen keresztül átpréseli magát a petesejt sejtfelszínéig

„…ketten próbálkoztak….”

4. A második felismerés és a gaméták fúziója Amint a spermium a zonán átért, a petesejt membránjánál találja magát. De ez még nem elég a „boldogsághoz”: most újra fel kell egymást ismerni. Ez a felismerés újabb receptorokat/ligandokat igényel. A spermium fejében ezt a feltételezések szerint a fertilin közvetítené. Ez a molekula szintén egy integráns membránfehérje, mely az egyenlítő mögött helyezkedik el (így nem válik le az AR során).

5. A petesejt kortikális granulumainak az exocitózisa: a polispermia meggátlása A petesejt membránjának felismerése és a sejtfúzió. A fúziót követően a petesejt kérgi szemcséinek tartalma exocitózissal kiürül. A CG-k exocitózisa (cortical granule reaction CGR) azt jelenti, hogy minden szemcse (a petesejt teljes felszínéről) pillanatszerűen (néhány milisecundum alatt) kiürülnek, amint az első spermium kötődik a petesejthez. A CG-k sokféle enzimet tartalmaznak. Vannak benne glikozidázok, melyek a ZP3 szénhidrát oldalláncait módosítják: továbbbi spermiumok AR nem tud végbemenni. Más enzim az ovoperoxidáz, mely a zonát megkeményíti (zona hardening: hiába történnének újabb AR-ók, a kiszabadult enzimek már nem képesek újabb lyukakat emészteni a zonába).

6. Az anyai és apai genetikai állomány egyesülése Fluoreszcens jelölés: kék szín: DNS; zöld szín: mikrotubulusok. A: az első meiotikus mosztódás az ovuláció előtt (csak petesejt). B: Spermiumbelépés (a petesejt bal oldalán), és a második meiotikus osztódás befejezése (fönt). C-E: A férfi és női előmagok egyesülése, első mitózis.

Oocyta aktiváció - - az oocyta és a spermium plazma membránjainak fúziója utáni történések A spermium behatolása után: -a második meiotikus osztódás befejeződik, a második sarki test a perivitellinális térbe kerül -pronuclearis membrán formálódik a női pronucleus körül -cytoplazmatikus faktorok szabályozzák az apai és anyai pronucleusok kialakulását -DNS replikáció -kromoszómák 2 kromatidból állanak -apai és az anyai pronucleuszok érintkeznek, nuclearis membránok eltűnnek, a kromoszómák keverednek -kromoszómák elrendeződnek a mitotikus orsó körül készülve a zygota első mitotikus osztódására Egy új ember élete kezdődik…..

Barázdálódás (moruláció): blasztomérákból álló szedercsíra (morula) 2 sejtes morula (A), 4 sejtes (B), 8 sejtes, nem kompakt morula (C), 8 sejtes kompakt morula (D), késői morula és blasztula (F). Az egyes sejteket blasztoméráknak hívjuk.

Kompaktizáció A nyolcsejtes morula jellegzetes átalakulása: az ugrásszerűen megnövő sejtadhézió következtében a nyolc egymást érintő golyó egymáshoz lapult sejtek alakját veszi fel. Kompaktizáció előtt és után

A kompaktizáció során megnő az egyes blasztomérák sejtfelszínén az E-cadherin expressziója. Ez okozza a sejtek egymáshoz tapadását. A transzmembrán E-cadherin (adhéziós molekula) a szomszédos sejtek E-cadherinjét felismerve, azzal kötődve „ragasztja” össze a sejteket. Ez a homofil kötés (az egyik sejten lévő cadherin a másik sejt cadherinjéhez kötődik) Ca-dependens: az ábra az EDTA-val történő Ca-megvonás hatását mutatja. A kompakt morula EDTA-s pufferben néhány perc alatt visszaalakul a kompaktizáció előtti alakúvá. + EDTA: 3-5 perc

Kompaktizáció (jelentősége: életünk első, jelentős differenciálódása) Az addigi blasztomérák azonos fejlődési potenciállal rendelkeztek (pluripotens), ez után a külső sejtek elsősorban a magzatburkok képzésére szakosodnak, míg az embrió teste a belül maradt (rekedt) 1-3 belső sejtből alakul ki. E-cadherin E-cadherin=uvomorulun: 54,000 D sejtadhéziós molekula

BLASZTULÁCIÓ –hólyagcsíra kialakulása – során differenciálódnak a magzatburkok képzéséért felelős, külső TROFOBLASZT (TROFEKTODERMÁLIS) sejtek, a belül maradó 1-3 sejtből alakul ki a belső sejtcsomó (inner cell mass: ICM).

BARÁZDÁLÓDÁS

A zona pellucida megmarad rajta egészen a beágyazódásig. Humán embrió preimplantációs fejlődésének „menetrendje”: HOL és MIKOR található az embrió? A zona pellucida megmarad rajta egészen a beágyazódásig.

Zona pellucida Trophoblast sejtek (felülnézetben macskakő kinézetűek) A kibújás (hatching): A beágyazódás előtt rövid idővel az (expandált) blasztula kibújik (hatching) a zona pellucidából. Ez a kibújás a (poláris) trophoblast sejtek enzimaktivitását igényli: tripszin szerű proteolitikus enzimeket szekretálnak ezek a sejtek, melyek hatásásra a kis nyílás emésztődik a zonába.

Implantáció Méh ürege Trophoblast sejtek ICM Méhnyálkahártya hámja és az alatta lévő kötőszövet Trofoblaszt invázió: a trofoblaszt sejtek a tumoros szövetek metasztázisához hasonló folyamatok révén ágyazódnak be a méh nyh-ba. Ehhez proteolitikus enzimeket (pl. az ú.n. mátrix metalloproteinázokat, MMP-et) használják a két bazális membrán átlépésére. A méhnyálkahártya igyekszik gátolni ezt. Terhesség során a trofoblaszt sejtek még a tüdőbe is eljuthatnak… Choriocarcinoma: a trofoblaszt sejtekből kiinduló tumor: a ma ismert, legerősebben áttétképző tumorféleség.

Assisted reproductive technology (ART) A legismertebb technikák: in vitro fertilization (IVF) intracytoplasmic sperm injection (ICSI) Orvosi javallat: petevezetőgyulladás (salpingitis) miatti átjárhatatlanság (pl. IVF-re); kevés, vagy hiányzó spermium az ejakulátumban (oligospermia, azoospermia; ICSI-re. Heretumorok (a citosztatikus kezelést megelőzően spermiumgyűjtés és fagyasztva tárolás). Sok pénz … Az első IVF gyermek 1978-ban született (UK). Nálunk: I.sz Szülészeti és Nőgyógyászati Klinikán végzik, de máshol is.                                                              Louise Brown - The first IVF baby - 1979 IVF has been a major breakthrough in treating infertility and is responsible for the birth of more than 500,000 healthy children around the world

Embriómanipulációs laboratóriumi módszerek felhasználásával történik. Az IVF lépései: 1. Szuperovuláció (a feleség hormonális kezelése FSH-val és hCG-vel), nagyszámú (8-10) petesejt nyerése céljából; 2. petesejtek gyűjtése (ultrhang megfigyelés mellett preovulatórikus tüszőkből leszívással); 3. hímivarsejtek gyűjtése; 4. in vitro fertilizáció; 5. Embriótenyésztés és az egészséges zigóták szelekciója 6. A kiválasztott zigóta(-ák) transzplantációja az méhbe (saját, vagy béranya). Etikai-jogi problémák: csak a gazdagok számára? Mi legyen a felesleges, egészséges zigótákkal (abortusz?)? arra használjuk az orvosi kapacitást, hogy 50 éves nőnek lehessen gyermeke? Mi van akkor a lefagyasztott embriókkal, ha a házaspár elválik?

Irodalom Vígh Béla: Humán ontogenezis, Alliter alapítvány 2006. Langman : Orvosi embriológia, Medicina 1999. Szövettan Szerk.:Röchlich Pál, Bp. 2006 Histology, a text and atlas M. H. Ross, New York 2005 Szentagothai J, Réthelyi M: Funkcionális anatómia, Medicina Köszönöm a figyelmet!

Petetüsző: a petesejt az első meiotikus osztódás profázisában van (primer oocita). Ovuláció: az FSH és LH hatására folytatódik a meiózis , létrejön a szekunder oocita, de ismét jön egy blokk, a második metafázisban. A fertilizáció szabadítja fel a szekunder oocitát ez alól a gátlás alól: a spermium már bent van a petesejt citoplazmájában, amikor befejeződik a petesejt meiózisa. A kész petesejt sejtmagja a női előmag (pronucleus), míg a spermiumé a hím előmag.

Barázdálódás

16-32 cells stage

A két ivarsejt fúziója I. Oocyta aktiváció - A fertilizáció előtt a secunder oocyta megrekedt a II. meiotikus osztódás metafázis szakaszában  A spermiummal való fúzió reaktivája a mitotikus apparátust  A meiotikus osztódás befejeződik -  Második poláris test megjelenik

A két ivarsejt fúziója II. -normál körülmények között 1 spermium lép be a haploid spermium pronucleusa + a haploid petesejt pronucleusa összeolvad: Zigóta: diploid sejt http://www.advancedfertility.com/triploid.htm Kroszoszóma szám helyreállítása Polyspermia következménye -2 spermium lép be→ triploid embrió -triploid kromoszóma szám -gyakran az embriók normálisnak néznek ki, de szinte az összes abortálódik 3 db pronucleus 69 kromoszóma!

Polispermia gátlása Részleges depolimerizáció (hipotézis) -alacsonyabb rendűekben bizonyított -Na csatornák nyílása a petesejt membránjában - részleges depolimerizáció (+20 mv) történik Kortikális reakció - petesejt plazmamembránja alatti un. kortikális granulumok exocytózisa -a spermium belépésenek hatására a Ca koncentráció megnő a petesejtben→kortikális granulumok exocitózisát idézi elő -a granulumok enzimjei módosítják a spermiumokat kötni képes ZP3-at