ELVÁLASZTÁSTECHNIKA III. IONCSERÉLŐ FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA

Az előadások a következő témára: "ELVÁLASZTÁSTECHNIKA III. IONCSERÉLŐ FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA"— Előadás másolata:

1 ELVÁLASZTÁSTECHNIKA III. IONCSERÉLŐ FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA
GÉLKROMATOGRÁFIA IONCSERÉLŐ FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA Dr. Kremmer Tibor EÖTVÖS LORÁND TUDOMÁNY EGYETEM Budapest

2 GÉLKROMATOGRÁFIA SEC GPC GEL CHROMATOGRAPHY - GEL FILTRATION
MOLEKULA MÉRET SZERINTI ELVÁLASZTÁSÚ KROMATOGRÁFIA SIZE EXCLUSION CHROMATOGRAPHY SEC GÉL PERMEÁCIÓS KROMATOGRÁFIA GEL PERMEATION CHROMATOGRAPHY GPC

3 Porath és Flodin (1954) Gel Filtration - GÉLSZŰRÉS
TÖRTÉNETI ÁTTEKINTÉS McBain (1929) Molecular Sieving - Molekula sziták, zeolitok – permutitok Deuel és Neukom (1954) Desalting - Poliszacharid gélek, sómentesítés Porath és Flodin (1954) Gel Filtration - GÉLSZŰRÉS Uppsala – Pharmacia Fine Chemicals, Sephadex – Sepharose gélek Gelotte (1960), Pedersen (1962), Flodin és Porath ( ) Size Exclusion Chromatography (SEC) Méret szerinti kizáródásos kromatográfia Szterikus-volumetrikus térfogati megoszlási modell Steere és Ackers (1962) Restricted Diffusion Chromatography Hjerten és Mosbach (1962) Molecular Sieve Chromatography A molekula „szitálás” matematikai modellje Moore (1964) Gel Permeatíon Chromatography (GPC) Casassa (1967), Ogston ( ) Termodinamikai értelmezés Ozmotikus nyomás – entrópia változás alapján Determann (1964) Gel Chromatography - GÉLKROMATOGRÁFIA

4 A GÉLKROMATOGRÁFIA ELVÁLASZTÁSI MECHANIZMUSÁNAK SZTERIKUS ELMÉLETI MODELLJE

5 PORÓZUS GÉLSZERKEZET ELEKTRONMIKROSZKÓPOS KÉPE

6 GÉLKROMATOGRÁFIA AZ ELVÁLASZTANDÓ ANYAG(OK) Kémiai tulajdonságai:
Szerkezet – stabilitás Funkcionális csoportok Biológiai aktivitás Molekula méret-tömeg, eloszlás Kis molekulák – Makromolekulák, Biopolimerek Fizikai tulajdonságai: Oldékonyság (poláris-apoláris) Szolvatáció – hidratáció Alak (globuláris - fibrilláris), konformáció – aggregáció Hidrodinamikai jellemzők Stokes-f rádiusz, diffúziós állandó, belső viszkozitás, flexibilitás

7 GÉLKROMATOGRÁFIA AZ ÁRAMLÓ FÁZIS AZ ELUENS – OLDÓSZER POLARITÁSA
pH, IONERŐSSÉG, ION MINŐSÉG VISZKOZITÁS (KONCENTRÁCIÓ) ADALÉKOK detergensek, stabilizálók, antioxidánsok, antibakteriális vegyületek, stb,

8 GÉLKROMATOGRÁFIA AZ ÁLLÓ (GÉL) FÁZIS
A TÖLTET KÉMIAI ÖSSZETÉTELE - SZERKEZETE Xerogel - liogel, térhálós polimerek, Biokompatibilitás, SZERVETLEN OXIDOK SiO2, Al203, hidroxi apatit, TiO2, üvegszemcsék (CPG), SZERVES POLIMEREK Dextrán, agaróz, akrilamid, akril-metak-rilát, poliéter- észter, polivinilalkohol, polisztirol-divinilbenzol, KEVERT TÍPUSOK Szervetlen-szerves, Szerves-szerves, Si02-poliszacharid Dextrán-agaróz, egyéb polimerek, akrilamid - PS-DVB

9 AGARÓZ GÉL SZERKEZETE (Araki, 1956)

10 TÉRHÁLÓS DEXTRÁN GÉLEK (Sephadex) SZERKEZETE

11 N,N’-METILÉN BIS-AKRILAMIDDAL TÉRHÁLÓSÍTOTT POLIAKRILAMID GÉLEK

12 GÉLKROMATOGRÁFIÁS TÖLTETEK
(GPC-SEC, PITTCON ) Elnevezés Összetétel Gyártó - Forgalmazó Sephacryl S Allil - dextrán akrilamid Pharmacia-LKB Superdex Dextrán-agaróz SynChrom GPC Polipropil-gliceril Waters- Millipore Sigmachrom GFC Dextrán - polietilénglikol Sigma-Aldrich Chitopearl Chitopack KO Kitin - kitosan poliszacharid Fuji Spinning Co. (Japán) Nucleosil Phenomenex GPC-P Daisogel 2205 SiO2 Macherey-Nagel Phenomenex Daiso (Japán) Unisphere Al2O3 Biotage HA Type 8 Hidroxiapatit Koken Science

13 GÉLKROMATOGRÁFIÁS TÖLTETEK
(GPC-SEC, PITTCON ) Elnevezés Összetétel Gyártó-Forgalmazó Styragel HMW PS – DVB Waters Fractogel TSK Szilikagél, ill. Merck G 3000 SW-PW Polivinil - sztirol polimer Toyopearl HW 55F TosoHaas Metachem GPC PS - DVB Metachem Tecnol. Jordi Gel DVB 500 Polidivinil benzol Jordi Associates BioSep SEC Phenomenex Asahipak HO Polivinil alkohol Asahi Chem. Co. PL gel MIXED Polietilénnel kevert PS-DVB Polymer PL Aquagel OH Polihidroxid Polihidroxil Laboratories Ltd, Shodex UT 800 KF 80 M Poliszachariddal kevert PS - DVB Showa Denko

14 Sephadex G gélek kromatográfiás tulajdonságai Géltípus
Gélágy térfogata cm3/g xerogél* Kizáródási moltömeg (kDa) Frakcionálási tartomány (kDa) G-10 2 – 3 ≈ 0,7 0,7 alatt G-15 2,5 – 3 – 5 ≈ 1,0 1,0 alatt G-25 4 – 6 5 1 –5 G-50 9 – 11 30 1,5 – 30 G-75 12 – 15 70 3 – 70 G-100 15 – 20 150 4 – 150 G-150 20 – 30 400 5 – 400 G-200 30 – 40 800 A száraz (xerogél) szemcsék mérete (μm) fajtától függően: durva (coarse) , közepes (medium) , finom (fine) 20-80, vagy szuperfinom (superfine) lehet.

15 HOMODISZPERZ SZTIROL-DIVINIL BENZOL KOPOLIMER SZEMCSÉK (BioBeads, 5 m) EM KÉPE

16

17

18 HOMODISZPERZ SZFEROID SZEMCSÉK TÉRBELI ILLESZKEDÉSÉNEK HEURISZTIKUS MODELLEZÉSE

19 HOMODISZPERZ SZFEROID SZEMCSÉK 6 ÉS 8 KOORDINÁCIÓS SZÁMMAL ILLESZKEDŐ TÉRBELI MODELLJEI

20 A GÉLKROMATOGRÁFIA SZTERIKUS-VOLUMETRIKUS EGYENLETE

21 AZ ÁLLÓ (GÉL) FÁZIS SZERKEZETE
A GÉLEK SZÁRAZANYAG (TÉRHÁLÓ) TARTALMA (súly %) Agaróz – 1.5 Sephadex Poliakrilamid A gélszemcsék 70 – 95 %-a víz (oldószer) ! ERŐSEN HIDRATÁLT (SZOLVATÁLT) SZERKEZET A víz (oldószer) molekulák (dinamikus egyensúlyban) a térhálóhoz rögzített térszerkezetet képeznek. A rögzített folyadéktér hozzáférhetőségét a térhálós szerkezet sűrűsége (keresztkötések száma, orientációja, „pórusméret”) és az oldott (elválasztandó) molekula mérete (tömege) határozza meg.

22 Az elválasztás technika szemlélete szerint a
GÉLKROMATOGRÁFIA a FOLYADÉK-FOLYADÉK MEGOSZLÁSI KROMATOGRÁFIA SPECIÁLIS HATÁRESETE ahol az álló és az áramló fázis ugyanaz az oldószer, a szerkezetileg rögzített és a folyadék halmazállapotú vízmolekulák. Az ELVÁLASZTÁS MECHANIZMUSA a fázisok közötti térfogati megoszlás (fázisarány, megoszlási együttható) a molekula méretének (tömegének) függvénye. Kav ~ f(log M) (A molekula rendelkezésére álló tér(fogat), „oldékonysága” különböző a két fázisban)

23 (Vt – V0) állandó érték  2/3 . Vt Kav = 0 – 1 log M  Kav
BIOPOLIMEREK MOLEKULA TÖMEGÉNEK (MÉRETÉNEK) MEGHATÁROZÁSA GÉLKROMATOGRÁFIÁVAL log M  Ve / V0 = Kav (Vt – V0) (Vt – V0) állandó érték  2/3 . Vt Kav = 0 – log M  Kav Determann egyenletek ( ) Dextrán (Sephadex) gélekre - fehérjékre, enzimekre Ve Vo logM = M0 - ( )  = a xerogél szemcse sűrűsége

24 MOLEKULA TÖMEG (MÉRET) MEGHATÁROZÁSA GÉLKROMATOGRÁFIÁVAL

25 A gélkromatográfia térfogati paramétereinek összefüggése a diffúziós állandóval

26 A MOLEKULA TÖMEGÉNEK ÉS MÉRETÉNEK ÖSSZEFÜGGÉSE
A gélkromatográfia alkalmazására vonatkozóan hangsúlyozni kell a molekula tömegének és (virtuális) méretének összefüggését (eltérését), amely a molekula fajlagos parciális térfogatával és a Stokes-féle rádiusszal írható le: M – molekulatömeg, N – Avogadro-féle szám, a – Stokes-féle rádiusz, D – diffuziós állandó, υ – molekula fajlagos parciális térfogata, η – viszkozitási együttható.

27 A GÉLKROMATOGRÁFIA MÓDSZEREI ÉS ALKALMAZÁSI TERÜLETEI
PREPARATÍV (BATCH) MINTA ELŐKÉSZÍTÉS - ANALITIKAI OSZLOPKROMATOGRÁFIA (LC – HPLC) - RÉTEGKROMATOGRÁFIA BEKONCENTRÁLÁS SÓMENTESÍTÉS PUFFER CSERE CSOPORT FRAKCIONÁLÁS TISZTÍTÁS – ELVÁLASZTÁS MOLEKULA TÖMEG (MÉRET) MEGHATÁROZÁS DETERGENS GÉLKROMATOGRÁFIA KROMATOFOKUSZÁLÁS

28 MOLEKULA TÖMEG MEGHATÁROZÁS GÉLKROMATOGRÁFIÁVAL

29 CSOPORT FRAKCIONÁLÁS GÉLKROMATOGRÁFIÁVAL

30 POLIETILÉNEK (2-32 kDa) ÉS SZÉNHIDROGÉNEK (C5-C58) ELVÁLASZTÁSA MÉRET SZERINTI KIZÁRÓDÁSOS (SEC) GÉLKROMATOGRÁFIÁVAL

31 TRANSZFERRIN TISZTÍTÁSA GÉLKROMATOGRÁFIÁVAL

32 HUMÁN SZÉRUM LIPO PROTEIN OSZTÁLYOK (SEM) CHYLOMICRON VLDL

33 A HUMÁN SZÉRUM LOW DENSITY LIPOPROTEIN (LDL) MOLEKULA DODEKAHEDRÁLIS (pentagon dodekaéder) MODELLJE

34 HUMÁN SZÉRUM LIPOPROTEIN OSZTÁLYOK ELOSZLÁSA
ELFO VLDL LDL HDL UC

35 HUMÁN SZÉRUM LIPOPROTEINEK ELVÁLASZTÁSA ELEKTROFORÉZISSEL AGARÓZ GÉLEN

36 SEC LDL HUMÁN SZÉRUM LIPOPROTEINEK ELVÁLASZTÁSA AGARÓZ (Sepharose 6B)
GÉLOSZLOPON VLDL HDL

37 SZOLUBILIZÁLÁS ÉS DETERGENS GÉLKROMATOGRÁFIA

38 DETERGENS GÉLKROMATOGRÁFIA MEMBRÁN FEHÉRJÉK ELVÁLASZTÁSÁRA ÉS TISZTÍTÁSÁRA

39 Ion Exchange Chromatography
IONCSERÉLŐ FOLYADÉK KROMATOGRÁFIA (IEX) Ion Exchange Chromatography

40 TÖRTÉNETI ÁTTEKINTÉS Ószövetség (Exodus xv. 23-5) víz tisztítás
Arisztotelész (cit. Hellferich, 1959) tengervíz sótlanítás Bacon (XVII. sz. eleje) alkimia, gyógyszerészet, derítés-perkolálás Thompson (1850), Way (1852) kationok adszorpciója agyagon Eichorn (1858), Boedecker (1859) egyensúlyi folyamatokra empirikus egyenletek Harms (1896) cukorgyártásban szabadalom Harms és Rümpler (1903) szervetlen szintetikus ioncserélők Gans (1905) Al-szilikátok alkalmazása vízlágyításra Fischer és Hoffmeister ( ) Kuhn, Lederer és Winterstein ( ) fehérje kémiai alkalmazások, tisztítás elválasztás Adams és Holmes (1935- ) polimerkémia, szerves ioncserélők, PDB műgyanták, bakelit (hanglemez !) Moore és Stein (1945) aminosav analizis - készülék

41 IONCSERÉLŐ FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA
AZ ELVÁLASZTANDÓ ANYAG(OK) ÖSSZETEVŐK IONOS, vagy IONIZÁLHATÓ TULAJDONSÁGA FUNKCIONÁLIS CSOPORTOK TÖLTÉSE ÉS MINŐSÉGE IZOELEKTROMOS PONT (makromolekula, biopolimer) A TÖLTÉS VISZONYOK (net charge) VÁLTOZÁSA A pH ÉS IONERŐSSÉG HATÁSÁRA MOLEKULA TÖMEG ÉS SZERKEZET DETEKTÁLHATÓSÁG BIOLÓGIAI AKTIVITÁS OLDÉKONYSÁG STABILITÁS

42 FEHÉRJE MOLEKULA SZERKEZETÉNEK
IONOS, VAGY IONIZÁLHATÓ FUNKCIONÁLIS CSOPORTJAI

43 IONCSERÉLŐ FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA
AZ ÁLLÓ FÁZIS – IONCSERÉLŐ TÖLTETEK GYENGE ERŐS ~~N+H2 < ~~N+HR < ~~N+R2 < ~~N+R3 erősen szubsztituens (R) függő

44 ERŐS - GYENGE IONCSERÉLŐ TÖLTETEK IONCSERÉLŐ FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA
KATION CSERÉLŐK Negatív töltésű funkcionális csoportokkal (szulfonil, karbonil, CM, PO4) ANION CSERÉLŐK Pozitív töltésű (primer, vagy szubsztituált, szekunder, tercier, kvaterner amino, imino, guanidil, stb.) funkcionális csoportokkal AMFOTER (kevert) TIPUSOK Pozitív és negatív töltésű funkcionális csoportokat tartalmazó komplex szerkezettel ERŐS - GYENGE IONCSERÉLŐK DISSZOCIÁCIÓ FOKA (pKA, pKK, pKI) SZERINT „TENTACLE” ELV - KAPACITÁS !

45 IONCSERÉLŐ KROMATOGRÁFIÁS TÖLTETEK
Elnevezés Összetétel (matrix) Gyártó - Forgalmazó Dowex A (WBA) C 88 Sztirol divinil benzol SIGMA Amberlit IR SERVA Sepharose Q, DEAE, ANX, SP, CM, Dextrán-agaróz kopolimer Pharmacia-LKB BioBeads MonoQ MonoP, MonoS Polivinil sztirol kopolimer Fractogel EMD DEAE 650 TMAE 650 SO3- 650 Poli metilmetakrilát Merck, Darmstadt AG MP, 50W, X4 Akrilát Poliamin BioRad Laboratories

46 KÉMHATÁS - pH - PUFFEREK
IONCSERÉLŐ FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA AZ ÁRAMLÓ FÁZIS A LEGFONTOSABB MODULÁLÓ TÉNYEZŐK KÉMHATÁS pH PUFFEREK AZ IONCSERE EGYENSÚLYI FÁZISÁBAN A MEGFELELŐ ELLENION ÉS AZ IONCSERÉLŐ TÖLTÉSÉNEK BIZTOSÍTÁSA AZ ELVÁLASZTANDÓ ANYAG(OK) TÖLTÉSÉNEK KIALAKÍTÁSA (pozitív, vagy negatív, pl. fehérjék) AZ IONCSERE pH-val MODULÁLT ELÚCIÓS FÁZISÁBAN AZ ELVÁLASZTANDÓ VEGYÜLETEK ÉS AZ IONCSERÉLŐ IONOS KÖLCSÖNHATÁSAINAK SZELEKTÍV MEGVÁLTOZTATÁSA

47 AZ IONCSERÉLŐ FOLYADÉKKROMATOGRÁFIÁBAN ÁLTALÁNOSAN HASZNÁLT PUFFER RENDSZEREK
pH tartomány Citrát (-dihidrogén, -hidrogén) 2 - 6, ,6 - 6,5 Ammónium foszfát 2,2 - 6,5 Kálium hidrogén ftalát Nátrium formiát 3,0 - 4,4 Nátrium acetát 4,2 - 5,4 Trietanolamin 6,7- 8,7 Nátrium borát 8,0 - 9,8 Ammónium acetát 8,6-9,8 Nátrium dihidrogén foszfát 2,0-6,0 és 8,0-12,0 Kálium dihidrogén foszfát 2,0-8,0 és 9,0-13,0 Bis-tris-propán 4.0 – 8.0

48 IONERŐSSÉG (I) - IONMINŐSÉG
IONCSERÉLŐ FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA AZ ÁRAMLÓ FÁZIS IONERŐSSÉG (I) IONMINŐSÉG összefüggésből számítható, ahol: ci az i-edik ion koncentrációja, zi az i-edik ion töltés számának négyzete.

49 POLARITÁS METANOL, ACETONITRIL
IONCSERÉLŐ FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA AZ ÁRAMLÓ FÁZIS POLARITÁS AZ ÁRAMLÓ FÁZIS POLARITÁSÁNAK VÁLTOZTATÁSA (CSÖKKENTÉSE) ADALÉK OLDÓSZEREKKEL METANOL, ACETONITRIL AZ IONOS KÖLCSÖNHATÁSOK ERŐSSÉGÉNEK VÁLTOZTATÁSA

50 IONCSERÉLŐ FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA
MUNKAFOLYAMATAI

51 EGYENSÚLYI ÁLLAPOT BEÁLLÍTÁSA KEMOSZORPCIÓ
IONCSERÉLŐ FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA EGYENSÚLYI ÁLLAPOT BEÁLLÍTÁSA (EKVILIBRÁLÁS) AZ ELVÁLASZTANDÓ ANYAGOK KÖTŐDÉSÉRE AZ EGYÉB (KONTAMINÁNS) ANYAGOK ELKÜLÖNÍTÉSÉRE A MEGFELELŐ ÁLLÓ FÁZIS KIVÁLASZTÁSA AZ ÁRAMLÓ FÁZIS PARAMÉTEREINEK OPTIMÁLÁSA pH, IONERŐSSÉG-MINŐSÉG, POLARITÁS KEMOSZORPCIÓ AZ ÁRAMLÓ FÁZISBAN OLDOTT MINTA KÖLCSÖNHATÁSBA HOZÁSA AZ ÁLLÓ FÁZISSAL AZ EGYÉB (NEM KÖTŐDŐ) ANYAGOK LEOLDÁSA AZ ÁRAMLÓ FÁZISSAL (ELÚCIÓ)

52 GRADIENS ELUCIÓ AZ ELUENS PARAMÉTEREINEK VÁLTOZTATÁSA
IONCSERÉLŐ FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA A DESZORPCIÓ MŰVELETEI (ELVÁLASZTÁS, FRAKCIONÁLÁS) AZ IONOS KÖLCSÖNHATÁSOK SZELEKTÍV MEGBONTÁSA AZ ÁRAMLÓ FÁZIS PARAMÉTEREINEK pH, IONERŐSSÉG, POLARITÁS SZISZTEMATIKUS SZAKASZOS és/vagy FOLYAMATOS, EGYIDEJŰ vagy KÜLÖNÁLLÓ VÁLTOZTATÁSÁVAL IZOKRATIKUS ELUCIÓ GRADIENS ELUCIÓ AZ ELUENS PARAMÉTEREINEK VÁLTOZTATÁSA SZAKASZOS - LÉPCSŐZETES LINEÁRIS, vagy EGYÉB (KONVEX, KONKÁV, stb.) FÜGGVÉNYKAPCSOLAT SZERINT

53 B > A A B pH V GRADIENS KÉPZÉS IONCSERÉLŐ FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA
(pH, IONERŐSSÉG, KONCENTRÁCIÓ, POLARITÁS) pH B > A A B V

54 A GRADIENS ELÚCIÓ FORMÁI ÉS ALKALMAZÁSA

55 IONCSERÉLŐ KROMATOGRÁFIÁS ELVÁLASZTÁSA
21 TERMÉSZETES AMINOSAV IONCSERÉLŐ KROMATOGRÁFIÁS ELVÁLASZTÁSA Dionex DC-6A ANIONCSERÉLŐ OSZLOPON (30X0,46 cm) 3 LÉPÉSES Na-citrát gradiens PROGRAMMAL DETEKTÁLÁS: NINHIDRIN (post-column)

56 TERMÉSZETES AMINOSAVAK FMOC SZÁRMAZÉKAINAK ELVÁLASZTÁSA IONCSERÉLŐ KROMATOGRÁFIÁVAL

57 FEHÉRJE MOLEKULA SZERKEZETÉNEK
IONOS, VAGY IONIZÁLHATÓ FUNKCIONÁLIS CSOPORTJAI

58 ENZIMEK TISZTITÁSA CSIRKE IZOMBÓL KATIONCSERÉLŐ (Mono S)
KROMATOGRÁFIÁVAL

59 CELLULÁZ TRIPSZINES EMÉSZTÉSI TERMÉKEINEK ELVÁLASZTÁSA
ANIONCSERÉLŐ (Mono Q) KROMATOGRÁFIÁVAL

60 KÍGYÓMÉREG ÖSSZETEVŐINEK ELVÁLASZTÁSA KATIONCSERÉLŐ
FOLYADÉKKROMATOGRÁFIÁVAL

61 HbA1C ELVÁLASZTÁSA ÉS MÉRÉSE KATIONCSERÉLŐ (Mono S)
KROMATOGRÁFIÁVAL

62 HUMÁN SZÉRUM LAKTÁT DEHIDROGENÁZ IZOENZIMEK ELVÁLASZTÁSA
HORIZONTÁLIS AGARÓZ GÉLELEKTROFORÉZISSEL

63 LAKTÁT DEHIDROGENÁZ (LDH) IZOENZIMEK ELVÁLASZTÁSA
KATION CSERÉLŐ FOLYADÉKKROMATOGRÁFIÁVAL

64 VIZELET FEHÉRJÉK ELVÁLASZTÁSA ANIONCSERÉLŐ (Mono Q)
KROMATOGRÁFIÁVAL

65 - LIGHT CHAINS FEHÉRJE KIMUTATÁSA KÓROS VIZELETBEN
(MYELOMA MULTIPLEX)

66 AGP HUMÁN SZÉRUM ELVÁLASZTÁSA ÉS MÉRÉSE ANIONCSERÉLŐ KROMATOGRÁFIÁVAL
KETTŐS pH – NaCl GRADIENSSEL pH 7,5  9,5 NaCl 0  350 mM

67 NUKLEOTID FOSZFÁTOK ELVÁLASZTÁSA ÉS MÉRÉSE IONCSERÉLŐ MonoQ – FPLC FOLYADÉKKROMATOGRÁFIÁVAL
MINTAELŐKÉSZÍTÉS: Szövetek, sejtek, biológiai folyadékok homogenizálva 0,7M perklórsavban, centrifugálás, felülúszó semlegesítve KHCO3-al FPLC oszlop: MonoQ, v. Polyanion SI HR 5/5 Áramló fázis: NH4-foszfát puffer, pH: 7, 0 Gradiens elúció: 0,1 – 1, 0 M Program szerint Áramlási seb: 0,75 mL/perc Detektálás: 254 nm

68 NUKLEOZIDOK ÉS NUKLEOTID FOSZFÁTOK ELVÁLASZTÁSA
ION-PÁR HPLC FOLYADÉKKROMATOGRÁFIÁVAL (Ade, Cyt, Gua, Uri, CMP, UMP, GMP, IMP, CDP, UDP, AMP, GDP, CTP, UTP, GTP, ADP, ATP) MINTAELŐKÉSZÍTÉS: Szövetek, sejtek, biológiai folyadékok homogenizálva 0,7M perklórsavban, centrifugálás felülúszó semlegesítve KHCO3-al HPLC oszlop: Hypersil ODS (25x0,46 cm, 5 m) Áramló fázis: ,025M TBAH-foszfát pH: 6,0 és 0,08M NaCl Lineáris gradiens elució: MeOH 0-20% (v/v) 45perc Áramlási seb: 0,75 mL/perc Detektálás: 254 nm

69 HPLC oszlop: Hypersil ODS (25x0,46 cm, 5 m) Áramló fázis:
A HPLC-ION PÁR KROMATOGRÁFIA PARAMÉTEREINEK ÖSSZEFÜGGÉSE k’ VÁLTOZÁSA AZ ÁRAMLÓ FÁZIS MeOH ÉS NaCl TARTALMÁNAK FÜGGVÉNYÉBEN A NUKLEOTID FOSZFÁTOK ELVÁLASZTÁSÁNAK OPTIMÁLÁSA AZ ÁRAMLÓ FÁZIS MeOH és/vagy NaCl KONCENTRÁCIÓJÁNAK VÁLTOZTATÁSÁVAL HPLC oszlop: Hypersil ODS (25x0,46 cm, 5 m) Áramló fázis: 0,025M TBAH-foszfát pH: 6,0 (Optimálisan) 0,08M NaCl

70 NÉHÁNY FONTOSABB ANION IONKROMATOGRÁFIÁS ELVÁLASZTÁSA

71 NÉHÁNY FONTOSABB KATION IONKROMATOGRÁFIÁS ELVÁLASZTÁSA

72

73

74 21 TERMÉSZETES AMINOSAV ELVÁLASZTÁSA Dionex D-6A OSZLOPON ANIONCSERÉLŐ KROMATOGRÁFIÁVAL

75

76

77

78