Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

A membrántranszport molekuláris mechanizmusai A membrántranszport alapjai 3. Felhasználtam Dr. Czirják Gábor ábraanyagát.

Hasonló előadás


Az előadások a következő témára: "A membrántranszport molekuláris mechanizmusai A membrántranszport alapjai 3. Felhasználtam Dr. Czirják Gábor ábraanyagát."— Előadás másolata:

1 A membrántranszport molekuláris mechanizmusai A membrántranszport alapjai 3. Felhasználtam Dr. Czirják Gábor ábraanyagát

2 A membrántranszport alapjai Membránpotenciál - bevezetés Általában a sejtek belső tere negatívabb az extracelluláris térnél nyugalmi körülmények között. V (  -70 mV) Intracelluláris Extracelluláris + (0 mV)

3 A membrántranszport alapjai Potenciálkülönbség elektrolitokban - néhány elvi lehetőség 1.Diffúziós potenciál Eltérő ionmobilitású anion és kation esetén. (pl. egy csepp sósav diffúziója) V + Cl - H+H+

4 ΔEΔE 1, az oldat ionjait a koncentráció különbség mozgatja a túloldalra 2, a különböző töltéssel rendelkező ionok átlépési sebessége a szemipermeábilis hártyán keresztül különböző – az ábrán az előre siető negatív töltésű ionok a túloldalon negatív töltésű réteget hoznak létre, így átmeneti feszültség: diffúziós potenciál alakul ki 3, ez lassítja a további anion előrehaladást de gyorsítja a kationok átjutását – ez a hatás csökkenti a diffúziós potenciált 4, a végén a koncentrációk kiegyenlítődnek, és a diffúziós potenciál eltűnik

5 -100 mV Hány darab anion átlépése kell -100 mV feszültség kialakításához egy 1 μm 2 -es membránon? Persze csak egy pillanatig, amíg a kation párja azonos irányban őt nem követi

6 A membrántranszport alapjai Potenciálkülönbség elektrolitokban - néhány elvi lehetőség 2. Membránpotenciál Előfeltétel: egyenlőtlen ionmegoszlás és szelektív permeabilitás A. Egyensúlyi potenciál Szelektív permeabilitású membrán (átmegy: K +, nem: Cl - ) + Cl mM KCl10 mM KCl Cl - K+K+ K+K+ K+K+ V -60 mV 1.K + áramlás a koncentráció- különbség miatt 2.A kialakuló feszültség leállítja a további áramlást (egyensúly)

7 Az egyensúlyi potenciál jellemzői -Néhány ezer ion egyenlőtlen megoszlása elég a potenciálkülönbség kialakításához, az ionkoncentrációk változása elhanyagolható. -Az egyensúlyi potenciál tartósan (elvileg végtelen ideig) fennállhat. Ilyenkor a koncentrációkülönbség miatt az egyik irányba ugyanannyi ion mozog, mint a potenciálkülönbség miatt a másikba. -Minél nagyobb a membránon átjutó ion két oldalon található koncentrációinak hányadosa, annál nagyobb a potenciálkülönbség. A membrántranszport alapjai Potenciálkülönbség elektrolitokban - néhány elvi lehetőség

8 Az egyensúlyi potenciál kiszámítása -Nernst egyenlet: E = ln E : membránpotenciál (volt) R: általános gázállandó (  8.31 J/mol/K) T: abszolút hőmérséklet (K) z : töltésszám (K + -ra: pl. +1) F : Faraday-állandó (  C/mol) -Gyakorlatban jól használható formája: E = log 10 - RT zF c BELSŐ c KÜLSŐ c BELSŐ c KÜLSŐ - 60 mV z

9 Az egyes ionok egyensúlyi potenciálja állati sejtekben fiziológiás ionmegoszlások esetén E K = log 10  - 90 mV 140 mM 4 mM - 60 mV +1 E Na = log 10  + 60 mV 15 mM 140 mM - 60 mV +1 E Cl = log 10  - 80 mV 4 mM 103 mM - 60 mV E Ca = log 10  mV M M - 60 mV +2

10 B, Donnan-potenciál -Ionokra átjárható, fehérjére nem permeábilis membrán esetén jön létre -A negatív töltésekkel rendelkező fehérjék oldalán nagyobb kation koncentráció és a kis molekulájú, permeábilis anion alacsonyabb koncentrációja alakul ki az ellenkező oldalhoz képest, egyensúlyi állapot formájában. -10 – -15 mV potenciálkülönbség jön létre. (A fehérjék oldala a negatívabb.) -A sejt nyugalmi membránpotenciálja döntően NEM a Donnan-potenciálon alapul. A membrántranszport alapjai Potenciálkülönbség elektrolitokban - néhány elvi lehetőség

11 C. Pumpapotenciál -A H + -pumpa, és állati sejtek esetén a nátrium pumpa (Na + /K + -ATPáz) elektrogén. (3 Na + ki, 2 K + be) -A H + -pumpa (és Na + -pumpa) folyamatos működése ezért negatívabbá teszi a sejt belsejét. Ez közvetlenül csak kb mV-tal járul hozzá a membrán-potenciálhoz. -A Na + -pumpa azonban az egyenlőtlen külső és belső Na + és K + koncentrációkat biztosítja, és így közvetve a membránpotenciál fenntartásához szükséges. A membrántranszport alapjai Potenciálkülönbség elektrolitokban - néhány elvi lehetőség

12 A sejt membránpotenciálja – rávezető gondolatkísérlet I. 100 mM KCl10 mM KCl 10 mM NaCl100 mM NaCl “I”“E”“E” P K >>P Na =0 P Cl =0 E m = ? + Cl - K+K+ K+K+ K+K+ V -60 mV K + egyensúlyi potenciál !! V m = -60 mV I K =I Na =0

13 A sejt membránpotenciálja – rávezető gondolatkísérlet II. 100 mM KCl10 mM KCl 10 mM NaCl100 mM NaCl “I”“E”“E” P Na >>P K =0 P Cl =0 E m = ? + Na + Cl - V +60 mV Na + egyensúlyi potenciál !! V m = +60 mV I K =I Na =0

14 A sejt membránpotenciálja – rávezető gondolatkísérlet III. 100 mM KCl10 mM KCl 10 mM NaCl100 mM NaCl “I”“E”“E” P Na =P K >0 P Cl =0 E m = ? I K = -I Na >0 V m = 0 mV Koncentráció- kiegyenlítődés Na + V 0 mV K+K+

15 A III. gondolatkísérlet ‘tanulságai’ 1.A kifelé áramló pozitív töltések áramát tekintjük pozitívnak hagyomány szerint. (A példában I K >0) 2.Stabil membránpotenciál esetén a membránon átfolyó összes áram összege nulla. (A példában I K +I Na =0) (Egyébként valamelyik oldalon töltésfelhalmozódás lenne, és V m változna) 3.Ha membrán többféle ionra is permeábilis, akkor hosszú idő után a koncentrációk kiegyenlítődhetnek. (A példában mindkét oldalon [Na + ] = [K + ] = 55 mM értéken). In vivo ezt a Na + -pumpa akadályozza meg.

16 IV. Az állati sejtek nyugalmi membránpotenciálja 100 mM KCl10 mM KCl 10 mM NaCl100 mM NaCl “I”“E”“E” P K >>P Na >0 P Cl =0 V m hol van az E K, 0, E Na értékekhez képest? I K = -I Na >0, mert egyensúly van (állandó V m ) E K < V m << 0 Koncentráció- kiegyenlítődés Na + V K+K+ +

17 A IV. gondolatkísérlet ‘tanulságai’ Egy ‘átlagos’ nyugvó állati sejtben: - kifelé K + áramot befolyásolja:  nagy koncentrációkülönbség  nagy K + permeabilitás  negatív membránpotenciál - befelé Na + áramot befolyásolja:  nagy koncentrációkülönbség  kis Na + permeabilitás  negatív membránpotenciál Így a két áram egyenlő  stabil nyugalmi V m

18 V m : E K és E Na között van. Hogy hol, az a P K és P Na arányától függ. P Na

P K esetben: E K <

19 Mitől és milyen irányban változhat a membránpotenciál? V m  : depolarizáció V m  : hiperpolarizáció “pozitívabbá válik” “negatívabbá válik” 1.Ionkoncentráció változás (in vivo nem jellemző) pl. [K + ] E   I K, out   depol. [Na + ] I   I Na, in   hiperpol. 2.Permeabilitás változás (in vivo a szab. fő útja) pl. P K   I K   hiperpol. P Na   I Na   depol.

20 Mi biztosítja a sejtmembrán szelektív permeabilitását?  Ioncsatornák Transzmembrán fehérjék, melyek hidrofil pórust képeznek ionok számára Egy ion transzportja során nincs konformációváltozás, csak nyitás  zárásnál Igen magas katalitikus szám ( ion/sec) Erősen szelektívek lehetnek (1 hiba/ ion) Nyitás  zárás szabályozott lehet, ez alapján csoportosíthatók: - ligandfüggő - háttér (csurgó, leak) - feszültségfüggő - mechanoszenzitív A membrántranszport alapjai Szelektív permeabilitás - ioncsatornák

21 Ionszelektivitás szerinti felosztás anioncsatornák (Cl -, NO 3 - ) kationcsatornák Szelektív (K +, Ca 2+ ) nem specifikus csak egyértékű (monovalens) ionokat ereszt át (Na + és K + ) kétértékű (bivalens) ionokat is átereszt (Na +, K + és Ca 2+ ) A membrántranszport alapjai Szelektív permeabilitás - ioncsatornák

22 A csatorna négy alegységből szerelődik össze. Amíg egyes K + -csatornák két, vagy négy alegységből szerelődnek össze, addig a Na + - és Ca 2+- csatornákat egyetlen hosszú polipeptid lánc alkotja. A membrántranszport alapjai Kation csatornák pórus hurkokkal K + csatorna alegységek Pórus motívum A különféle ioncsatorna-féleségek alegységeinek síkban kiterített szerkezete. Egy pórus hurkokkal rendelkező K + - ioncsatorna háromdimenziós modellje oldal- és felülnézetben.

23 Nátrium & Kalcium Feszültség- kapuzott KQTeagsloCNGNovel > 23 gén K + csatornák KVLQT KVLQT2 eag erg elk slo slo2/slack A Ca 2+ - és a Na + -csatornák génjei egy ősi K + -csatorna- gén ismételt duplikációja és módosulása nyomán képződtek. Az ioncsatornák génjei az evolúció során kialakult és bevált funkció megőrződéséről, variálódásáról szólnak.

24 A szűk járat belső felszínén karbonil- (C=O) oxigén- atomok vannak. Az oxigénatomok részleges negatív töltést hordoznak, és úgy helyezkednek el, hogy a járaton áthaladó K + -ionok a hidrátburok vízmolekulái helyett az oxigénatomokkal lépjenek kölcsönhatásba. A kölcsönhatás energetikailag kedvező környezetet teremt az ionok áthaladásához. Szűk nyaki rész: 1,2 nm hosszú, átmérője 0,28 nm. A csatorna átmérője szabja meg, hogy milyen ionok haladhatnak át rajta. A nyaki rész falát a pórusmotívum (signature sequence) aminosavjai burkolják. Mivel a K + -ionok hidrátburkát alkotó vízmolekulák 0,28 nm-re vannak a K + -ion középpontjától, a járat túl szűk egy K + -ion áthaladásához. A hidrátburok vízmolekuláit csak komoly energiabefektetés árán lehet eltávolítani, ám a K + -csatornák működésük során nem fogyasztanak energiát. Mégis, miként lehetséges az, hogy a nyitott K + -csatornán másodpercenként nagyjából egymillió K + -ion halad át?

25 A szelektivitási filter szerkezete: a VGYG motívum KcsA (2TM1P) csatornában A szelektivitási filter szerkezete (karbonil oxigének)

26 K + ionok (zöld) és víz molekulák (piros) áthaladása a póruson. „Billiárd-típusú” átjutás Roderick MacKinnon (47), laureate of the Nobel Prize in Chemistry 2003

27 A membrántranszport alapjai Kálium ionok átjutása Kv1.2 csatornán – számítógépes szimuláció

28 A K + -nál (1,33 Å) kisebb átmérőjű Na + -ionok (0,95 Å) számára a karboniloxigén-atomok (C=O) túlságosan távol helyezkednek el, amiért nem tudnak az ionnal kölcsönhatásba lépni, ami miatt a Na + -ionok nem tudnak átjutni a K + -csatornákon. Másképpen: a Na + -ionok erősebben kötik a vizet, mint a K + -ionok, nem képesek elegendően közel menni a szűrőhöz, hogy elveszítsék a hidrátburkot. Szelektivitás: 1:1000. K+K+ Na + A membrántranszport alapjai A szelektivitási filter szerkezete (a K + szelektivitás mechanizmusa)

29 Kapuzás a “belső szájadékban” Depolarizáció során a kapuzó hélix a sejthártya külseje felé mozdul, és miközben megváltozik az ioncsatorna szerkezete, kinyílik, rajta ionok áramlanak át. Állati sejtekben az átáramló ionáram erőssége már a depolarizáció alatt csökkenni kezd, mert a csatorna inaktiválódik. A kapuzó hélix (H5) helyzetét a sejtmembránban az határozza meg, hogy milyen kölcsönhatás van a membrán két oldalán felhalmozódott töltések és a kapuzó hélixek töltése között.

30 Állati sejtekben a feszültségfüggő Na + csatorna inaktiválódik (akciós potenciál). Növényeknél nem jellemző a hasonló inaktiváció (pl. GORK 30 percig is aktív marad), az AP másként keletkezik. A csatornának 3 funkcionális állapota van: ZártNyitott Inaktív (nem vezet) Depolarizáció Spontán Repolarizáció A membrántranszport alapjai Az inaktiváció

31 EmEm I Na Idő (ms) zártnyitottinaktív Az inaktiváció kísérletes kimutatása (makroszkópos áram)

32 Idő (ms) A megnyílás és az inaktiváció is statisztikus jelenség az elemi áram szintjén EmEm elemi áramok több mérés során egy csatornán összegzett áram

33 Inaktiváció “tömeszeléses” mechanizmussal: N-típusú inaktiváció Az N típusú inaktiváció esetében az ioncsatorna fehérje N-terminálisa a pórus citoplazma felőli bejáratához kötődik, bedugaszolja a csatornát

34 Kapuzás a szelektivitási filterben: C-típusú inaktiváció C típusú inaktivációt - nevével ellentétben - nem a fehérje C-terminálisa, hanem a szűk nyaki rész körüli fehérjerészek okozzák: az ioncsatorna a fényképezőgépek blendéjéhez hasonlatos módon záródik.

35 A szűrő kálium-koncentrációtól függően zárt (low K + ) és nyitott (high K + ) állapotú lehet. Ha az aktivációs kapu nyílik (1), több kálium jut a szűrő közelébe, high K + állapotú szűrő  nyitódás (2). Zárt aktivációs kapu esetén a low K + állapot alakul ki. Ez a magyarázata a milliszekundumos nagyságrendű „pislákoló” ioncsatorna nyitódásnak-záródásnak, mely még nyitott feszültség-függő aktivációs kapu esetén is mérhető. aktivációs kapu szelektivitási szűrő A szelektivitási szűrő K + -függő szerkezetváltozásának biológiai jelentősége. 1 2

36 A membrántranszport alapjai K-csatorna inaktiváció Nyugalmi helyzet, zárt csatorna Depolarizált sejthártya, nyitott helyzet Depolarizált sejthártya, N-típusú inaktiváció Depolarizált sejthártya, C-típusú inaktiváció

37 A sejt ionáramainak mérése: patch clamp Sejtre tapasztott (cell-attached) felállás Feszültség clamp Mekkora áramot kell átfolyatnom, hogy V m az általam megkívánt érték legyen? Pipetta széle és a membrán között NAGY (G  ) ellenállású kapcsolat (seal). mért csatornák

38 A sejt ionáramainak mérése: patch clamp Teljes sejt (whole cell) felállás Feszültség clamp mért csatornák

39 A sejt ionáramainak mérése: patch clamp Kivágott folt (excised patch) felállás Feszültség clamp mért csatorna/csatornák (Akár egy csatorna árama is mérhető, az áram pA ( A) nagyságrendű.) Zárt Nyitott

40 Az ioncsatornák működése: makroszkópos áram (sok ugyanolyan csatorna együttes árama) K + szelektív pórus (P K konstans, nem függvénye V m -nek), szimmetrikus oldatok I V m (mV) Feszültség-áram összefüggés C 1 < C 2 C2C2 C1C1 Pl.: mindkét oldalon 4 mM [K + ] mindkét oldalon 140 mM [K + ]

41 K + szelektív pórus, aszimmetrikus oldatok I V m (mV) C2C2 C1C1 Pl.: belül C 2 =140, kívül C 1 =4 mM [K + ] I K =0, ha V m =E K EKEK

42 Feszültségfüggő, kifelé rektifikáló K + csatorna (pl. GORK) I V m (mV) EKEK nyitási valószínűség leak (csurgó) K + áram (E K fölött I K >0) I V m (mV) Feszültségfüggő csatorna K + árama (E K és küszöb között I K =0) küszöb  -30 mV EKEK POPO V m (mV)

43 Befelé rektifikáló K + csatorna (pl. KAT1) I V m (mV) EKEK leak (csurgó) K + áram I (nagyítva!) V m (mV) bef. rekt. csatorna K + árama (E K felett: I K >0 csak egy szűk tartományban) EKEK POPO V m (mV) nyitási valószínűség

44 Cl - szelektív pórus, aszimmetrikus oldatok I V m (mV) C1C1 C2C2 Pl.: belül C 1 =140, kívül C 2 =15 mM [Cl - ] I Cl =0, ha V m =E Cl E Cl

45 Feszültségfüggő Cl - -csatorna I V m (mV) E Cl V m (mV) E Cl nyitási valószínűség leak (csurgó) Cl - áram Feszütségfüggő csatorna Cl - árama küszöb  -75 mV I E Cl pozitív értékű, mert [Cl - ] cyt > [Cl - ] extracell V m (mV)

46 A membrántranszport alapjai 6. A növényi ioncsatornák működése PM, Anion csatornák Turgor beállításnál hipotóniás stressz esetén a sók kiáramlását szabályozza Legfőképp Cl - ionról van szó, ezek Ca 2+ -aktivált csatornák, 2 osztálya van: S(slow)-típusú és R(rapid)-típusú feszültségfüggő anion csatorna E Cl általában pozitív értéket ér el, mert [Cl - ] cyt > [Cl - ] extracell 3 db fontos funkció: A csatornák nyitódása nem csak Cl - vesztést eredményez, hanem membrán depolarizációt is okoz. Ez aktiválja a kifelé egyenirányító K + -csatornákat a sók kiáramlásánál. A jelátvitel során tapasztalható membrán-depolarizációban központi jelentőségű. Erős hiperpolarizáció esetén nyitódnak (ha a befelé egyenirányító K + -csatornák működése gátolt pl. kevés külső K + cc. esetén) R-típusú S-típusú Szerkezetük: 13 TM szegmens


Letölteni ppt "A membrántranszport molekuláris mechanizmusai A membrántranszport alapjai 3. Felhasználtam Dr. Czirják Gábor ábraanyagát."

Hasonló előadás


Google Hirdetések