Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

ELVÁLASZTÁSTECHNIKAI MÓDSZEREK ELMÉLETE ÉS GYAKORLATA Dr. Kremmer Tibor VI. FOLYADÉKKROMATOGRÁFIÁS MÓDSZEREK GÉLKROMATOGRÁFIA EÖTVÖS LORÁND TUDOMÁNY EGYETEM.

Hasonló előadás


Az előadások a következő témára: "ELVÁLASZTÁSTECHNIKAI MÓDSZEREK ELMÉLETE ÉS GYAKORLATA Dr. Kremmer Tibor VI. FOLYADÉKKROMATOGRÁFIÁS MÓDSZEREK GÉLKROMATOGRÁFIA EÖTVÖS LORÁND TUDOMÁNY EGYETEM."— Előadás másolata:

1 ELVÁLASZTÁSTECHNIKAI MÓDSZEREK ELMÉLETE ÉS GYAKORLATA Dr. Kremmer Tibor VI. FOLYADÉKKROMATOGRÁFIÁS MÓDSZEREK GÉLKROMATOGRÁFIA EÖTVÖS LORÁND TUDOMÁNY EGYETEM Budapest – 2013

2 GÉLKROMATOGRÁFIA GEL CHROMATOGRAPHY - GEL FILTRATION MOLEKULA MÉRET SZERINTI ELVÁLASZTÁSÚ KROMATOGRÁFIA SIZE EXCLUSION CHROMATOGRAPHY SEC GÉL PERMEÁCIÓS KROMATOGRÁFIA GEL PERMEATION CHROMATOGRAPHY GPC

3 TÖRTÉNETI ÁTTEKINTÉS McBain (1929) Molecular Sieving - Molekula sziták, zeolitok – permutitok Deuel és Neukom (1954) Desalting - Poliszacharid gélek, sómentesítés Porath és Flodin (1954) Gel Filtration - GÉLSZŰRÉS Uppsala – Pharmacia Fine Chemicals, Sephadex – Sepharose gélek Gelotte (1960), Pedersen (1962), Flodin és Porath ( ) Size Exclusion Chromatography (SEC) Méret szerinti kizáródásos kromatográfia Szterikus-volumetrikus térfogati megoszlási modell Steere és Ackers (1962) Restricted Diffusion Chromatography Hjerten és Mosbach (1962) Molecular Sieve Chromatography A molekula „szitálás” matematikai modellje Moore (1964) Gel Permeatíon Chromatography (GPC) Casassa (1967), Ogston ( ) Termodinamikai értelmezés Ozmotikus nyomás – entrópia változás alapján Determann (1964) Gel Chromatography - GÉLKROMATOGRÁFIA

4 A GÉLKROMATOGRÁFIA ELVÁLASZTÁSI MECHANIZMUSÁNAK SZTERIKUS ELMÉLETI MODELLJE

5 Térhálós szerkezetű polidextrán alapú xerogél (Sephadex) pásztázó elektronmikroszkópos (SEM) képe.

6 PORÓZUS SZILIKA GÉL ELEKTRONMIKROSZKÓPOS KÉPE

7 GÉLKROMATOGRÁFIA AZ ELVÁLASZTANDÓ ANYAG(OK) Kémiai tulajdonságai: Szerkezet – stabilitás Funkcionális csoportok Biológiai aktivitás Molekula méret-tömeg, eloszlás Kis molekulák – Makromolekulák, Biopolimerek Fizikai tulajdonságai: Oldékonyság (poláris-apoláris) Szolvatáció – hidratáció Alak (globuláris - fibrilláris), konformáció – aggregáció Hidrodinamikai jellemzők Stokes-f rádiusz, diffúziós állandó, belső viszkozitás, flexibilitás

8 GÉLKROMATOGRÁFIA AZ ÁRAMLÓ FÁZIS AZ ELUENS – OLDÓSZER POLARITÁSA pH, IONERŐSSÉG, ION MINŐSÉG VISZKOZITÁS (KONCENTRÁCIÓ) ADALÉKOK detergensek, stabilizálók, antioxidánsok, antibakteriális vegyületek, stb,

9 AZ ÁLLÓ (GÉL) FÁZIS A TÖLTET KÉMIAI ÖSSZETÉTELE - SZERKEZETE Xerogel - liogel, térhálós polimerek, Biokompatibilitás, SZERVETLEN OXIDOK SiO 2, Al 2 0 3, hidroxi apatit, TiO 2, üvegszemcsék (CPG), SZERVES POLIMEREK Dextrán, agaróz, akrilamid, akril-metakrilát, poliéter-észter, polivinilalkohol, polisztirol-divinilbenzol, KEVERT TÍPUSOK Szervetlen-szerves - Si0 2 - poliszacharid, Szerves-szerves – dextrán - agaróz, Egyéb polimerek - akrilamid - PS-DVB GÉLKROMATOGRÁFIA

10 AGARÓZ GÉL SZERKEZETE (Araki, 1956)

11 TÉRHÁLÓS DEXTRÁN GÉLEK (Sephadex) SZERKEZETE

12 N,N’-METILÉN BIS-AKRILAMIDDAL TÉRHÁLÓSÍTOTT POLIAKRILAMID GÉLEK

13 GFC - SEC POLÁRIS – HIDROFIL GÉLKROMATOGRÁFIÁS TÖLTETEK ElnevezésÖsszetételGyártó - Forgalmazó Sephacryl S Allil - dextrán akrilamidPharmacia-LKB Superdex Dextrán-agarózPharmacia-LKB SynChrom GPCPolipropil-glicerilWaters- Millipore Sigmachrom GFC Dextrán - polietilénglikolSigma-Aldrich Chitopearl Chitopack Kitin – kitosan poliszacharid Fuji Spinning Co. (Japán) Nucleosil Phenomenex GPC-P Daisogel 2205 SiO 2 Macherey-Nagel Phenomenex Daiso (Japán) UnisphereAl 2 O 3 Biotage HA Type 8HidroxiapatitKoken Science

14 GPC – SEC APOLÁRIS – HIDROFÓB/ORGANOFIL GÉLKROMATOGRÁFIÁS TÖLTETEK ElnevezésÖsszetételGyártó-Forgalmazó Styragel HMWPS – DVBWaters Fractogel TSKSzilikagél, ill.Merck G 3000 SW-PWPolivinil - sztirol polimer Toyopearl HW 55FTosoHaas Metachem GPC PS - DVBMetachem Tecnol. Jordi Gel DVB 500Polidivinil benzolJordi Associates BioSep SEC PS - DVBPhenomenex Asahipak HOPolivinil alkoholAsahi Chem. Co. PL gel MIXED Polietilénnel kevert PS-DVB Polymer PL Aquagel OHPolihidroxidPolihidroxil Lab Ltd, Shodex UT 800 KF 80 M Poliszachariddal kevert PS – DVB kopolimer Showa Denko

15 Kereskedelmi HPLC-SEC oszloptöltetek Nanorészecskék, makromolekulák, biopolimerek elválasztására ElnevezésÖsszetételGyártó-Forgalmazó Sepharose CL 2B, 4B, 6BDextrán-agarózPharmacia LKB Sephacryl S 200, S 300Dextrán-akrilátPharmacia LKB Styragel HMWPS – DVBWaters Fractogel TSKSzilikagél, ill. polimerMerck TSKgel G 3000 SW-PWPolivinil - sztirol polimerTosoHaas Toyopearl HW 55F, -75Etilénglikol/metakrilát kopolimerTosoHaas Shodex HA 30Hidrofil PS - DVBTosoHaas Shodex UT 800 KF 80 MPoliszachariddal kevert PS – DVBShowa Denko PL aquagel OHPolihidroxid- polimer gyantaPolymer Laboratories PL gel MIXEDPolietilénnel kevert PS-DVBPolymer Laboratories Phenogel OHHidrofil polimer gyantaPolymer Laboratories NUCLEOGEL GFCHidrofil polimer gyantaMacherey-Nagel BioSep SEC PS – DVBPhenomenex Asahipak HOPolivinil alkoholAsahi Chem. Co. Jordi Gel DVB 500Polidivinil benzolJordi Associates Metachem GPC PS - DVBMetachem Technology

16 Sephadex G gélek kromatográfiás tulajdonságai GéltípusGélágy térfogata cm 3 /g xerogél* Kizáródási moltömeg (kDa) Frakcionálási tartomány (kDa) G-102 – 3 ≈ 0,7 0,7 alatt G-152,5 – 3 – 5 ≈ 1,0 1,0 alatt G-254 – 651 –5 G-509 – 11301,5 – 30 G-7512 – – 70 G – – 150 G – – 400 G – A száraz (xerogél) szemcsék mérete (μm) fajtától függően: durva (coarse) , közepes (medium) , finom (fine) 20-80, vagy szuperfinom (superfine) lehet.

17 HOMODISZPERZ SZTIROL-DIVINIL BENZOL KOPOLIMER SZEMCSÉK (BioBeads, 5  m) SEM KÉPE

18

19

20 HOMODISZPERZ SZFEROID SZEMCSÉK TÉRBELI ILLESZKEDÉSÉNEK HEURISZTIKUS MODELLEZÉSE

21 HOMODISZPERZ SZFEROID SZEMCSÉK 6 ÉS 8 KOORDINÁCIÓS SZÁMMAL ILLESZKEDŐ TÉRBELI MODELLJEI

22 A GÉLKROMATOGRÁFIA SZTERIKUS-VOLUMETRIKUS EGYENLETE

23 AZ ÁLLÓ (GÉL) FÁZIS SZERKEZETE A GÉLEK SZÁRAZANYAG (TÉRHÁLÓ) TARTALMA (súly %) Agaróz 0.3 – 1.5 Sephadex Poliakrilamid A gélszemcsék 70 – 95 %-a víz (oldószer) ! ERŐSEN HIDRATÁLT (SZOLVATÁLT) SZERKEZET A víz (oldószer) molekulák (dinamikus egyensúlyban) a térhálóhoz rögzített térszerkezetet képeznek. A rögzített folyadéktér hozzáférhetőségét a térhálós szerkezet sűrűsége (keresztkötések száma, orientációja, „pórusméret”) és az oldott (elválasztandó) molekula mérete (tömege) határozza meg.

24 Az elválasztás technika szemlélete szerint a GÉLKROMATOGRÁFIA a FOLYADÉK-FOLYADÉK MEGOSZLÁSI KROMATOGRÁFIA SPECIÁLIS HATÁRESETE ahol az álló és az áramló fázis ugyanaz az oldószer, a szerkezetileg rögzített és a folyadék halmazállapotú vízmolekulák. Az ELVÁLASZTÁS MECHANIZMUSA a fázisok közötti térfogati megoszlás (fázisarány, megoszlási együttható) a molekula méretének (tömegének) függvénye. K av ~ f(log M) (A molekula rendelkezésére álló tér(fogat), „oldékonysága” különböző a két fázisban)

25 Determann egyenletek ( ) Dextrán (Sephadex) gélekre - fehérjékre, enzimekre BIOPOLIMEREK MOLEKULA TÖMEGÉNEK (MÉRETÉNEK) MEGHATÁROZÁSA GÉLKROMATOGRÁFIÁVAL logM = M 0 - (  ) VeVe VoVo  = a xerogél szemcse sűrűsége log M  V e / V 0 = K av (V t – V 0 ) (V t – V 0 ) állandó érték  2/3. V t K av = 0 – 1 log M  K av

26 MOLEKULA TÖMEG (MÉRET) MEGHATÁROZÁSA GÉLKROMATOGRÁFIÁVAL

27 A gélkromatográfia térfogati paramétereinek összefüggése a diffúziós állandóval

28 A MOLEKULA TÖMEGÉNEK ÉS MÉRETÉNEK ÖSSZEFÜGGÉSE A gélkromatográfia alkalmazására vonatkozóan hangsúlyozni kell a molekula tömegének és (virtuális) méretének összefüggését (eltérését), amely a molekula fajlagos parciális térfogatával és a Stokes-féle rádiusszal írható le: M – molekulatömeg, N – Avogadro-féle szám, a – Stokes-féle rádiusz, D – diffuziós állandó, υ – molekula fajlagos parciális térfogata, η – viszkozitási együttható.

29 A GÉLKROMATOGRÁFIA MÓDSZEREI ÉS ALKALMAZÁSI TERÜLETEI PREPARATÍV (BATCH) MINTA ELŐKÉSZÍTÉS - ANALITIKAI OSZLOPKROMATOGRÁFIA (LC – HPLC) - RÉTEGKROMATOGRÁFIA BEKONCENTRÁLÁS SÓMENTESÍTÉS PUFFER CSERE CSOPORT FRAKCIONÁLÁS TISZTÍTÁS – ELVÁLASZTÁS MOLEKULA TÖMEG (MÉRET) MEGHATÁROZÁS DETERGENS GÉLKROMATOGRÁFIA KROMATOFOKUSZÁLÁS

30 MOLEKULA TÖMEG MEGHATÁROZÁS GÉLKROMATOGRÁFIÁVAL

31 CSOPORT FRAKCIONÁLÁS GÉLKROMATOGRÁFIÁVAL

32 POLIETILÉNEK (2-32 kDa) ÉS SZÉNHIDROGÉNEK (C 5 -C 58 ) ELVÁLASZTÁSA MÉRET SZERINTI KIZÁRÓDÁSOS (SEC) GÉLKROMATOGRÁFIÁVAL

33 TRANSZFERRIN TISZTÍTÁSA GÉLKROMATOGRÁFIÁVAL

34 CHYLOMICRON VLDL HUMÁN SZÉRUM LIPO PROTEIN OSZTÁLYOK (SEM)

35 A HUMÁN SZÉRUM LOW DENSITY LIPOPROTEIN (LDL) MOLEKULA DODEKAHEDRÁLIS (pentagon dodekaéder) MODELLJE

36 HUMÁN SZÉRUM LIPOPROTEIN OSZTÁLYOK ELOSZLÁSA VLDL LDL HDL ELFO UC

37 HUMÁN SZÉRUM LIPOPROTEINEK ELVÁLASZTÁSA ELEKTROFORÉZISSEL AGARÓZ GÉLEN

38 HUMÁN SZÉRUM LIPOPROTEINEK SEC ELVÁLASZTÁSA AGARÓZ (Sepharose 6B) GÉLOSZLOPON VLDL LDL HDL

39 PLAZMA MEMBRÁN ÖSSZETEVŐK SZOLUBILIZÁLÁSA DETERGENSEKKEL (SDS - Na-dodecil szulfát) Detergens Sejtmembrán SDS (90 0 – 5 min) Fehérje és lipid micellák

40 Májsejtek plazma membrán fehérje és lipid tartalmának elválasztása detergens gélkromatográfiával Sepharose 4B oszlopon. - o - - ● - - X -

41


Letölteni ppt "ELVÁLASZTÁSTECHNIKAI MÓDSZEREK ELMÉLETE ÉS GYAKORLATA Dr. Kremmer Tibor VI. FOLYADÉKKROMATOGRÁFIÁS MÓDSZEREK GÉLKROMATOGRÁFIA EÖTVÖS LORÁND TUDOMÁNY EGYETEM."

Hasonló előadás


Google Hirdetések