FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA

Az előadások a következő témára: "FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA"— Előadás másolata:

1 FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA
Fekete Jenő: Folyadékkromatográfia, BME jegyzet, Budapest, 2003. Shimadzu:Introduction to HPLC

2 Kromatográfiás módok összehasonlítása
A HPLC a kis illékonyságú poláris anyagok analízisére legalkalmasabb.

3 Elválasztás függése a szelektivitástól és a hatékonyságtól
HPLC hatékonysága mérsékelt (< N) , de szelektív).

4 A zónaszélesedés okai HPLC-nél
A HPLC-ben a diffúziós folyamatok és az áramlási sebesség sokkal kisebb mint GC-nél.

5 Van Deemter görbe a HPLC-ben
A lassú diffúzió miatt nincs felszálló ág a lassú áramlási sebességeknél.

6 Nagyhatékonyságú kromatográf (HPLC) vázlata
A gázmentesítés (degasser) fontos, hogy a pumpa folyadékot tudjon felszívni, és csökkenjen az alapvonal zaj (noise).

7 HPLC készülék A pumpák 250 att-ig dolgoznak általában
Fontos az oldószer gázmentesítése

8 Pumpa Pump head Motor & Cam Check valves Plunger Plunger seal

9 Oldószerkeverék előállítása HPLC pumpával
Kisnyomású ágon a pumpa beállított arányban beszívja az eluenseket, amik nagynyomású ágon összekeveredve jutnak az oszlopra.

10 Folyadékkromatográf pumpája
A folyadékáram pulzálását általában két pumpa ellentétes járásával csillapítják

11 Elúciós gradiens előnye HPLCben
A gradiens gyorsabb analíziseket és érzékenyebb detektálást biztosít.

12 Oldószerek polaritási sora

13 Forgócsapos (rotary valve) injektálás HPLCben
A hurok (loop) pontos mennyiségű, áramlás megzavarása nélküli beinjektálást biztosít.

14 On-line SPE-HPLC analízis elrendezés
Az előoszlopon gyűjtés alatt gyenge a mozgófázis. Lemosás erősebb mozgófázissal történik, de úgy hogy a minta szűk tartományban maradjon a fő oszlop elején.

15 Poláris növényvédő szerek HPLC analízise

16 Integrált előoszlop HPLCben
Az előoszlop megvédi a fő oszlopot az elkoszolódástól, és a kioldódástól.

17 HPLCs előoszlop Az előoszlop megvédi a fő oszlopot az elkoszolódástól,
és a kioldódástól.

18 Dead volume Az oszlop csatlakozásnál vigyázni kell a holttér elkerülésére. Male nut Dead volume Tube Excellent connection Poor connection

19 Szemcseméret és porozitás befolyása a hatékonyságra
A hatékonyság annál jobb minél kisebbek a szemcsék, de a nyomásesés határt (3-5 µm) szab a méretcsökkenésnek. A porozitásra a terhelhetőség miatt van szükség. A mély üregek rosszul mosottak. Gömb alakú szemcsék a legelőnyösebbelk.

20 A kisebb méretű szemcsék alkalmazása a fejlődés iránya

21

22 Javasolt pórusátmérő különböző molekulasúlyú mintákhoz
Nagyobb molekula súlyú anyag nagyobb pórusátmérőt igényel, hogy a lukba beleférjen.

23 Különböző HPLC töltetek összehasonlítása
Előnyök: monolit > gömbalakú > szabálytalan

24 Új fejlesztésű szemcse

25 Normál/Fordított fázis
Állófázis Mozgó fázis Normál Magas polsarítású (hidrofil) Alacsony polaritású (hidrofób) Fordított A fordított fázist használják leggyakrabban.

26 Oszloppolarítás - retenciós idő
C18 (ODS) OH weak strong CH3

27 Borított szilika szemcse szerkezete

28 A leggyakrabban használt C18 HPLCs állófázis szerkezete
Apoláris anyagoknak nagyobb a retenciója. Mozgófázis poláris oldószer (víz, metanol, acetonitril).

29 Oldószer erőség – retenciós idő fordított fázison
Mobile phase: Methanol /Water Methanol / Water 60 / 40 Methanol / Water 70 / 30 Methanol / Water 80 / 20

30 C18 fázis kondicionálása
Metanolos mosás kell, hogy a víztartalmú mozgófázis nedvesítse a C18 állófázist.

31 Oldószererősség hatása fordított (C18) HPLCs állófázison
Az oldószererősség csökkenésével nő a retenció és a felbontás.

32 Poláris növény védőszerek HPLCs vizsgálata
Aminok speciális passziválású állófázist igényelnek

33 Karbamát és triazin növényvédő szerek HPLC-UV vizsgálata

34 Normál fázisú, adsorptiós kromatográfia
Az állófázisnak csak a felszíne lép kölcsönhatásba

35 Normál fázisú analízis

36 Ioncserés kromatográfia elve
Az állófázis ionjai visszatartják az ellentétes töltésű ionokat. Az erősebb ionoknak ( Cl- > CO32-) nagyobb a retenciója.

37 Anionok ionkromatogramja
Az állófázis anioncserélő gyanta

38 Anionok analízise ppb szinten ionkromatográffal szúpresszor segítségével

39 Gélkromatográfia (gel chromatography, size exclusion chromatography) eleve
A nagy molekulák mivel nem férnek be a kis csatornákba kisebb kölcsönhatással bírnak, ezért hamarabb elúálódnak.

40 Gélkromatográfia (méretkizárásos, size exclusion), alapja
A nagy molekulák mivel nem férnek be a kis csatornákba kisebb kölcsönhatással bírnak, ezért hamarabb elúálódnak.

41 Molecular imprinted phase (MIP)
Nagy szelektivitás, gyenge hatékonyság

42 Karbamát növényvédő szerek HPLC-UV analízise
A HPLC-s analízisek előtt a karbamát peszticid tartalmat egy adatként mérték.

43 Karbamát rovarölő szerek HPLC-UV analízise speciálisan kifejlesztett állófázison
Az anyagok hőbomlásuk miatt nem alkalmasak GCs elemzésekre

44 Különböző detektorokkal elérhető kimutatási határ, és szelektivitásuk jellemzése
Electrokémiai Sz Tömeg spektrométer U Fluoreszcens Sz Ultraibolya Sz Törésmutató U Fényszórás U Sz, szelektív; U, univerzális

45 UV/VIS detektor Ein Eout l A A = e·C·l = –log (Eout / Ein) C
C : Concentration Cell Ein Eout A C D2 / W Lamps l A = e·C·l = –log (Eout / Ein) (A : Absorbance)

46 Diodasoros (DAD) UV-VIS detektor vázlata

47 Különböző funkciós csoportokhoz ajánlott detektálási hullámhossz HPLC-UV analíziseknél

48 Fényszórásos HPLC detektor
Universális érzékeny detektor

49 On line HPLC/MS kapcsolat