B SEJT AKTIVÁCIÓ.

Az előadások a következő témára: "B SEJT AKTIVÁCIÓ."— Előadás másolata:

1 B SEJT AKTIVÁCIÓ

2 RECEPTOR VEZÉRELT SEJTAKTIVÁCIÓ
Ligand Ligand keresztkötés Konformáció változás JEL JEL

3 A RECEPTOR KERESZTKÖTÉSE JELÁTVITELI MECHANIZMUSOKAT INDÍT BE
ligand kináz aktiváció foszforiláció adaptorok toborzása JEL Gén átírás Transzkripciós faktorok aktiválása

4 THE IgM B-CELL RECEPTOR
a a THE IgM B-CELL RECEPTOR antigen binding mIg molecule H L V b a Ig-a/Ig-b heterodimer Signal transduction Lyn Kinases Syk Btk SHP-1 Phosphatases SLP-65/BLNK PLC HS1 Vav Adaptors + substrates

5 A B-SEJT RECEPTOR FELÉPÍTÉSE
Ig-a/CD79a a b Y Ig-b/CD79b Ig domén + CHO ITAM ITAM: YxxL x7 YxxI ITAM: Immunoreceptor Tyrosine-based Activation Motif

6 B-SEJT RECEPTOR SZIGNÁLÚTVONAL
1. kereztkötés Ag Lyn 2. Src-family kináz activáció P és ITAM foszforiláció 3. Syk toborzás és aktiváció Syk 4. SLP foszforiláció + Ca felszabadulás SLP P Kalcium felszabadulás P = ITAM

7 A LIMFOCITA AKTIVÁCIÓ KINETIKÁJA
ANTIGEN SIGNAL1. Nyugvó limfocita G0 proliferáció DNS szintézis Effektor sejt Memóris sejt Transzport Membrán változások RNS és fehérje szintézis Ko-receptor Adhéziós molekulák Citokinek 2. jel Nyugvó limfocita G0 PTK aktiváció RNS szintézis szabad Ca Fehérje szintézis fehérje foszforiláció DNS szintézis Limfoblaszt 0 10sec 1min 5min hr hrs hrs hrs

8 AZ ELLENANYAG SOKFÉLESÉG GENETIKAI HÁTTERE

9 AZ ELLENANYAGOK SZERKEZETE
Nehéz lánc (H) VH VL CH Könnyű lánc (L) CL KOMPLEMENT AKTIVÁCIÓ SEJTHEZ KÖTŐDÉS LEBOMLÁS TRANSZPORT

10 AZ IMMUNOGLOBULINOK JELLEGZETES AMINOSAV SZERKEZETE
Mieloma multiplex Plazmasejt tumorok – tumorsejtek a csontvelőben Monoklonális eredetű emberi immunoglobulinok a szérumban (50-100mg/ml) Rodney Porter és Gerald Edelman 1959 – 1960 fehérje tisztítás AZ IMMUNOGLOBULINOK JELLEGZETES AMINOSAV SZERKEZETE Gél elektroforézis Redukció L H 50 kDa Nehéz lánc 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 25 kDa Könnyű lánc Variábilis Constans

11 AZ ELLENANYAG SOKFÉLESÉG GENETIKAI HÁTTERE
VL VH S – S S – S A sokféleség kialakulásának mechanizmusa? Más szabályok a variábilis és konstans régiók kialakulására? Szimmetrikus molekula  két azonos VH és VL  mindkét kromoszóma ugyanazt a szekvenciát kódolja?

12 V C V2 C V3 V1 A MOLEKULÁRIS BIOLÓGIAI DOGMÁJA
Gén Protein 1 GÉN = 1 FEHÉRJE A MOLEKULÁRIS BIOLÓGIAI DOGMÁJA AZ IMMUNOGLOBULIN SZEKVENCIA JELLEGZETESSÉGE ELMÉLETEK 1 GÉN magas szomatikus mutációs ráta a V régióban V C Sok GÉN ( – ) V2 C V3 V1

13 AZ IMMUNOGLOBULINOK MOLEKULÁRIS GENETIKÁJA
Hogyan magyarázható az ellenanyagok kettős funkciója? Dreyer & Bennett feltételezése (1965) Egy adott izotípusú ellenanyag valószínűleg: Az egyetlen C régiót kódoló gén a csíravonalban el van választva a V régió génektől A V génekből többféle áll rendelkezésre Feltételezhető egy mechanizmus, amely a V és C géneket fúzionálja egy teljes immunoglobulin génné A feltételezés ellentétben állt az akkor elfogadott nézettel, amennyiben a DNS (genetikai állomány) egy adott egyed minden sejtjében azonos

14 A Dreyer - Bennett hipotézis igazolása
C A csíravonalban egyetlen C gén van (L-lánc), amely a sok V géntől távol helyezkedik V A B-sejtekben a V és C géneket valamilyen mechanizmus egy teljes immunoglobulin génné fúzionálja C V V Módszer a sok V gén létezésének és a V – C gén átrendeződés igazolására

15 Módszer C V Csíravonal DNS C V Átrendezett DNS Megközelítés:
Specifikus cDNS próbák a különböző V régiók és a C régiók elkülönítéséhez DNS restrikciós enzimek a DNS fragmentáláshoz A csíravonalnak (pl. méhlepény) és az érett B-sejteknek (pl. plazmocitóma/mielóma) a DNS-ei eltérőek

16 Susumi Tonegawa kísérlete 1975 Restrikciós enzim hasítás
DNA-kivonás Restrikciós enzim hasítás Gél elektroforézis Southern blot VC Kb 6,0 1,5 V-próba 4,0 C V C-próba B-sejt Méhlepény 6.0 Kb V C 4.0 Kb 1.5. Kb V C B-sejt

17 Sok variábilis gén van, de csak egy konstans gén
KÖVETKEZTETÉS Sok variábilis gén van, de csak egy konstans gén V C CSÍRAVONAL A V és C gének csak a B-sejtekben kerülnek egymás mellé C V B-SEJT GÉN SZEGMENSEK SZOMATIKUS ÁTRENDEZŐDÉSE EGY GÉNNÉ Fehérje Gén

18 Az Ig gének szekvenálása tovább bonyolította a képet
A csíravonal VL gének szerkezete hasonló volt a Vk és and Vl könnyű láncok esetében A csíravonal és az átrendezett DNS nem volt azonos CL VL ~ 95as ~ 100as L CL VL ~ 95as ~ 100as JL Az aminosavak egy része a kis számú J (Joining) régiókból származik L CL VL ~ 208as L Honnan származik a 13 extra aminosav?

19 Az Ig H lánc további sokféleséggel jellemezhető
VH DH JH CH A nehéz lánc a JH és CH gének közötti szakaszon további (0 – 8) aminosavat tartalmaz Ezek a D (DIVERSITY) régióból származnak A nehéz lánc kialakulásához 3 rekombinációs folyamatra van szükség JH to DH , VH to JHDH, and VHJHDH to CH VL JL CL L A könnyű lénc kialakulásához 2 rekombinációs folyamatra van szükség : VL to JL and VLJL to CL

20 AZ IMMUNOGLOBULIN POLIPEPTID LÁNCOKAT TÖBB GÉN SZEGMENS KÓDOLJA
AZ IMMUNOGLOBULIN GÉN SZEGMENSEK ELRENDEZŐDÉSE 2 kromoszóma kappa könnyű lánc gén szegmensek 22 kromoszóma lambda könnyű lánc gén szegmensek 14 kromoszóma nehéz lánc gén szegmensek AZ IMMUNOGLOBULIN GÉN SZEGMENSEK SZÁMA Variábilis (V) Diverzitás (D) Kapcsoló (J) Gén szegmens Könnyű lánc Nehéz lánc kappa lambda

21 A KAPPA (κ) LÁNC GÉN SZEGMENSEK SZOMATIKUS ÁTRENDEZŐDÉSE
Jκ Vκ B-sejt2 80 Vκ 4 Jκ Vκ Jκ Csíravonal B-limfocita fejlődés során Jk Jκ Vκ B-sejt1 DNS

22 A K-LÁNC KIFEJEZŐDÉSE VκJκ Vκ Cκ J Cκ J Vκ Cκ J Vκ Cκ J Vκ pA P E E
Primer RNS átirat Cκ E J Vκ mRNA Cκ J Vκ AAAA Transzláció Cκ J Vκ Fehérje

23 A VH GÉN SZEGMENSEK SZOMATIKUS ÁTRENDEZŐDÉSE
4 JH VH VH VH D D D D JH JH JH JH A B sejt fejlődés során JH JH D VH JH JH D VH

24 AZ ANTIGÉN RECEPTOROK SOKFÉLESÉGE
VH D JH VL JL V-Domének C-Domének VH-D-JH VL-JL

25 AZ IMMUNOGLOBULIN GÉN SZEGMENSEK ÁTRENDEZŐDÉSÉNEK SORRENDJE
D – J rekombináció V – DJ rekombináció VDJ – δ transzkripció δ transzláció Pót könnyű lánc V – J rekombináció VJ –  (vagy VJ - ) transzkripció  vagy  transzláció B-sejt mIgD mIgM

26 A kombinációs sokféleség becslése
A funkcionális V, D és J gének száma: 40 VH x 27 DH x 6JH = 6,480 kombináció A D leolvasható 3 keretben: 6,480 x 3 = 19,440 kombináció 29 Vk x 5 Jk = 145 kombináció 30 Vl x 4 Jl = 120 kombináció = 265 különböző könnyű lánc Amennyiben a H és L láncok véletlenszerűen párosodnak mint H2L2 19,440 x 265 = 5,151,600 lehetőség Csak a KOMBINÁCIÓS sokféleség A valóságban bizonyos H + L kombinációk nem fordulnak elő, mert instabilak Bizonyos V és J gének gyakrabban fejeződnek ki, mint mások A KAPCSOLÁSI sokféleség tovább növeli a szekvenciák számát A POTENCIÁLIS B-SEJT KÉSZLET KIALAKULÁSA

27 A SZOMATIKUS GÉN ÁTRENDEZŐDÉS EREDMÉNYE
A gén szegmensek kombinációja nagy számú, eltérő variábilis régióval rendelkező nehéz (H) és könnyű (L) láncot eredményez, amelyek egy adott egyedben a különböző B-sejt klónokban fejeződnek ki Az egyik kromoszómán létrejött sikeres gén átrendeződés gátolja a gén átrendeződést a másik kromoszómán ALLÉL KIZÁRÁS 3. Egy B-sejt csak egy típusú nehéz (H) és egy típusú könnyű (L) láncot termel ELKÖTELEZŐDIK EGY TÍPUSÚ ANTIGÉN KÖTŐHELY LÉTREHOZÁSÁRA 4. A teljes B sejt készlet különbözőképpen átrendezett immunoglobulin gének termékeit kifejező egyedi B-sejtekből áll

28 A sikeres génátrendeződés gátolja a rekombinációt a másik kromoszómán
A B-SEJT ANTIGÉN FELISMERŐ RECEPTOR ÉS AZ ELLENANYAGOK SOKFÉLESÉGÉT MEGHATÁROZÓ GENETIKAI MECHANIZMUSOK Szomatikus génátrendeződés A variábilis domének kialakulása a VJ (L-lánc) és a VDJ (H-lánc) gének rekombinációjával Hogyan képes a B sejt csak egyfajta könnyű és egyfajta nehéz láncot kifejezni? Annak ellenére, hogy minden B sejtben egy apai és egy anyai Ig lókusz is jelen van A gének nagy része ko-dominánsan kifejeződik Hogyan történik a B sejtekben az egyik allél aktiválása és a másik gátlása? ALLÉL KIZÁRÁS A sikeres génátrendeződés gátolja a rekombinációt a másik kromoszómán Csak egyféle H- és L-lánc szintetizálódik A sejtfelszínre 2 H- és 2 L-láncból álló dimerek kerülnek ki AZ ANTIGÉN JELENLÉTÉTŐL FÜGGETLEN FOLYAMATOK A B-SEJT ÉRÉS SORÁN A CSONTVELŐBEN MENNEK VÉGBE

29 AZ IMMUNOGLOBULIN SZINTÉZIS FOLYAMATA
Szekretált Ig Membrán Ig Golgi ER A H és L láncok külön riboszómákon szintetizálódnak Leader szekvencia Riboszóma mRNS

30 IZOTÍPUS VÁLTÁS

31 Ig IZOTÍPUSOK Cµ IgM Cγ1 IgG Cγ2 IgG Cγ3 IgG Cγ4 IgG Cα IgA Cε IgE IgM
C Cδ C3 C1 Cε2 C1 C 2 C4 Cε1 C2 C Cδ C Cδ Ig IZOTÍPUSOK Cµ IgM Cγ1 IgG Cγ2 IgG Cγ3 IgG Cγ4 IgG Cα IgA Cε IgE C Cδ C C IgM

32 Switch régiók Ca2 Ce Cg4 Cg2 Ca1 Cg1 Cg3 Cd Cm
Sg3 Sg1 Sa1 Sg2 Sg4 Se Sa2 Sm A C-régiók előtt a DNS-ben ismétlődő szekvenciákból álló „switch” régiók helyezkednek el. (Kivétel a Cd régió). Az Sm 150 [(GAGCT)n(GGGGGT)] ismétlődő szakaszból áll (n=3 – 7) Az izotípus váltás mechanizmusa hasonló a V(D)J rekombinációhoz Az izotípus váltás nem a csontvelőben, hanem az antigénnel való találkozást követően T-sejt segítséggel megy végbe

33 Switch rekombináció Ca2 Ce Cg4 Cg2 Ca1 Cg1 Cg3 Cd Cm V23D5J4 V23D5J4
Sg3 Cm Cd Cg3 V23D5J4 Cg1 Sg1 Ca1 Cm Cd Cg3 V23D5J4 Cg3 V23D5J4 Ca1 Cg3 V23D5J4 IgG3 termelés IgM IgG3 V23D5J4 Ca1 IgA1 termelés IgG3 IgA1 V23D5J4 Ca1 IgA1 termelés IgM  IgA1 Minden rekombinációnál a konstans régiók kivágódnak A génsorrend miatt egy IgE – termelő B sejt nem tud IgM, IgD, IgG1-4 vagy IgA1 termelésre váltani

34 Az ellenanyag izotípus váltás
Az immunválasz során egy ellenanyag specificitása (VDJ és VJ) nem változik (az affinitás érés során változhat az affinitása) Az ellenanyagok effektor funkciói az immunválasz során jelentősen változnak Az ellenanyagok képesek a variábilis domén megtartása mellett más konstans régióra váltani, ami más effektor funkciókra teszi képessé az molekulát J régiók Ca2 Ce Cg4 Cg2 Ca1 Cg1 Cg3 Cd Cm Az emberi nehéz lánc gének C régióinak sorrendje, ami meghatározza az izotípus váltás lehetőségeit

35 Minden izotípus rekombináció produktív
C Cδ C2 C4 C C Átrendezett DNS IgM-termelő sejt Switch regions C Cδ, C2, C4 IZOTÍPUS VÁLTÁS Minden izotípus rekombináció produktív Más szignál szekvenciák és enzimek mint a VDJ átrendeződésnél Antigén stimuláció után Nem véletlenszerű Külső jelek irányítják C C Átrendezett DNS IgE-termelő sejt Első RNA átirat C mRNS Hiper IgM szindróma 2. típus Activation Induced Cytidine Deaminase RNS editing enzim NINCS HIPERMUTÁCIÓ ÉS IZOTÍPUS VÁLTÁS  nehéz lánc

36 SZOMATIKUS HIPERMUTÁCIÓ

37 VL CDR1 CDR2 CDR3 Complementary Determining Region = hipervariábilis régió

38 A VARIÁBILIS RÉGIÓ SZERKEZETE
Hipervariábilis (HVR) vagy komplementaritást meghatározó régiók (CDR) HVR3 FR1 FR2 FR3 FR4 HVR1 HVR2 Variabilitás Index 25 75 50 100 Amino savak sorszáma N – C terminális 150 Váz (framework) szakaszok

39 SZOMATIKUS HIPERMUTÁCIÓ
0. nap Ag Plazmasejt klónok 1 2 3 4 5 6 7 8 ELSŐDLEGES I.V. AFFINITÁS ÉRÉS 9 1011 12 13 14 15 16 14. nap Ag 17 1819 20 21 22 23 24 MÁSODLAGOS I.V.

40 A hipermutációs folyamat aktivált T limfociták közreműködését igényli
A szomatikus hipermutáció affinitás éréshez vezet Clone 1 Clone 2 Clone 3 Clone 4 Clone 5 Clone 6 Clone 7 Clone 8 Clone 9 Clone 10 CDR1 CDR2 CDR3 6. nap CDR1 CDR2 CDR3 8. nap 12. nap 18. nap Hátrányos mutáció Előnyös mutáció Semleges mutáció Kisebb affinitás – Nincs klonális szelekció Nagyobb affinitás – Klonális szelekció Azonos affinitás – Nem hat a klonális delécióra A hipermutációs folyamat aktivált T limfociták közreműködését igényli A mutáció ‘hot spots’ (CDR régiók) körül halmozódnak, amit a kettős láncú töréseket követő hiba javító DNS repair enzim állít helyre

41 ELLENANYAG ÁLTAL KÖZVETÍTETT EFFEKTOR FUNKCIÓK
Neutralizáció – az ellenanyag kötődése gátolja a patogén sejtfelszíni kötődését, belépését a sejtbe vagy szaporodását Opszonizáció – az ellenanyag kötődése elindítja a komplement aktivációt és lehetővé teszi a sejthez való kötődést a komplement (CR1) és Ig (FcR) kötő receptorokon keresztül Az ellenanyag izotípusok eltérő komplement aktiváló és FcR kötő sajátsággal rendelkeznek

42 A SZEKRETÁLT ELLENANYAGOK HOZZÁKÖTŐDNEK AZ ANTIGÉNHEZ = IMMUNKOMPLEX KÉPZŐDÉS
KOMPLEMENT AKCTIVÁCIÓ OPSZONIZÁCIÓ IMMUNKOMPLEX Makrofág FcR CR Ig Fc régió Konformáció változás? Asszociáció? KOMPLEMENT AKTIVÁCIÓ – klasszikus útvonal SEJTHEZ KÖTŐDÉS – citofil sajátság FAGOCITÓZIS LEBONTÁS IZOTÍPUS FÜGGŐ IgG1 és IgG3 >> IgG2 és IgG4

43 ELLENANYAG KÖZVETÍTETTE EFFEKTOR FUNKCIÓK
SPECIFIKUS ELLENANYAG Bakteriális toxin Baktérium az interstitiumban Baktérium a plazmában Toxin receptor Neutralizáció Opszonizáció Komplement activáció KOMPLEMENT Internalizáció Fagocitózis Fagocitózis és lizis

44 AZ ELLENANYAGOK EFFEKTOR FUNKCIÓI
GÁTLÁS Baktérium kötődése az epitél sejtekhez Vírus kötődése a receptorhoz Bakteriáláis toxinok kötődése a célsejthez NEUTRALIZÁCIÓ Az ellenanyagok kis hányada PLAZMA SEJT OPSZONIZÁCIÓ Az ellenanyag kötődése fokozza a fagocitózist FcR FcR CR1 Komplement C3b KOMPLEMENT AKTIVÁCIÓ Opszonizáció C3b által FAGOCITA SEJTEK BEKEBELEZÉS, LEBONTÁS

45 A B – SEJT DIFFERENCIÁCIÓT A T-SEJTEK SEGÍTIK
ANTIGÉN CITOKINEK PLAZMA SEJT IZOTÍPUS VÁLTÁS ÉS AFFINITÁS ÉRÉS CSAK T-SEJT SEGÍTSÉGGEL MEGY VÉGBE HOGYAN LÁTJÁK A T-SEJTEK AZ ANTIGÉNT?