Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

IMMUNKOMPLEXEK KIALAKULÁSA, SZEROLÓGIAI REAKCIÓK (KOMPLEMENT-MEDIÁLT LÍZIS, PRECIPITÁCIÓ, AGGLUTINÁCIÓ) - Régi, megbízható módszerek - sok közülük most.

Hasonló előadás


Az előadások a következő témára: "IMMUNKOMPLEXEK KIALAKULÁSA, SZEROLÓGIAI REAKCIÓK (KOMPLEMENT-MEDIÁLT LÍZIS, PRECIPITÁCIÓ, AGGLUTINÁCIÓ) - Régi, megbízható módszerek - sok közülük most."— Előadás másolata:

1 IMMUNKOMPLEXEK KIALAKULÁSA, SZEROLÓGIAI REAKCIÓK (KOMPLEMENT-MEDIÁLT LÍZIS, PRECIPITÁCIÓ, AGGLUTINÁCIÓ) - Régi, megbízható módszerek - sok közülük most is használatban van - Olcsó (gyakran szemmel látható az eredmény mindenféle kémiai reakció nélkül) - Ag-Ea kölcsönhatásokat, epitop (Ag determináns) fogalmát segít megérteni

2 AZ IgG TÉRSZERKEZETE A hinge régió flexibilitásának köszönhetően változatos sztérikus viszonyok között is képes az antigénhez kötni, sőt bivalenciájának köszönhetően akár két antigént is „összefogni”.

3 Az ellenanyag izotípusok és az antigénkötőhelyek száma

4 Az antigén-ellenanyag kapcsolódást követő másodlagos kölcsönhatásokon alapuló módszerek SZEROLÓGIAI REAKCIÓK Ag-EA nem kov. kölcsh. Immunkomplex Két azonos kötőhellyel rendelkező (bivalens Ea) két Ag-t kapcsol össze 1. Precipitáció oldott Ag + Ea (immunkomplex) oldhatatlan precipitátum Agglutináció részecske természetű Ag + Ea nagyméretű aggregátumok (sejtek) 2. komplement rendszer aktiválódása Komplement-függő lízis

5 Az antigén-ellenanyag kapcsolódást követő másodlagos kölcsönhatásokon alapuló módszerek nagy Ag felesleg kicsi oldható kevés immunkomplexek csapadék szabad Ag megfelelő Ag-Ea nagy sok csapadék immunkomplex nincs szabad Ag és Ea nagy Ea felesleg kevés csapadék szabad Ea EKVIVALENCIA PONT: Az az Ag-Ea arány, amelynél maximális precipitáció érhető el: Precipitáció

6 Precipitációs görbe antigéntúlsúly EKVIVALENCIA ellenanyagtúlsúly sok csapadék kevés csapadék növekvő ellenanyag mennyiség (animált ábra)

7 antigéntúlsúly ellenanyagtúlsúly sok csapadék kevés csapadék növekvő ellenanyag mennyiség EKVIVALENCIA ellenanyagtúlsúly antigéntúlsúly növekvő antigén mennyiség sok csapadék kevés csapadék Precipitációs görbe

8 IMMUNKOMPLEX (≠ PRECIPITÁTUM) Az antigénnek az ellenanyaggal alkotott (oldható) komplexei. A komplexképződés pillanatszerűen is lejátszódhat, egyensúlyra vezető folyamat. Nem azonos a precipitátummal! A precipitátum az immunkomplexekből fizikai-kémiai folyamatok során keletkező oldhatatlan csapadékot jelenti. Időigényes folyamat. Precipitáció (animált ábra)

9 Ekvivalenciát befolyásoló tényezők: -valencia (kapcsolatteremtő képesség) mono-, bi-,…, poli-valens -hőmérséklet - pH - sókoncentráció - idő - egyéb (pl. PEG az oldékonyságot csökkenti)

10 MÓDSZEREK Immundiffúzió: (lágy gélközegben) - radiális egyszerű (Ea-t v. Ag.-t keverik a gélbe) - radiális kettős (mindkét komponens diffundál a gélben) Elektroforézis: - immunoelektroforézis (többkomponensű Ag-t elektroforetizálják, majd polivalens ellenszérummal reagáltatják.) - rakéta elektroforézis (Ea-t gélbe keverik, Ag-t elektroforetizálják) - két-dimenziós elektroforézis (elektroforetikus tul. alapján szétválasztott frakciókat ellenanyagtartalmú gélen újra elektroforetizálják.) Turbidimetria (a fényszórással arányos fényintenzitás csökkenését méri) Nefelometria (a szórt fény intenzitását méri)

11 Antigén koncentráció meghatározása radiális immundiffúzióval Antigént tartalmazó lyuktól való távolság Az optimális arányt adó antigén koncentráció. IgG koncentráció mérése szérumból radiális immundiffúzióval. A standardok átmérője lehetővé teszi a kalibrációs görbe megrajzolását. A vizsgált szérum minta IgG koncentrációja a görbéről leolvasható: - T1 – IgG mielómás beteg szérumából; 15 mg/ml - T2 – hipogammaglobulinémiás beteg széruma; 2,6 mg/ml - T3 – normál szérum; 9,6 mg/ml A gyűrű átmérője IgG koncentráció (mg/ml) Radiális immundiffúzió: az antigén koncentráció és a precipitációs gyűrű méretének kapcsolata. A nagyobb koncentrációjú antigén (Ag1) a lyuktól messzebbre vándorolva éri el azt az egyensúlyi állapotot, ahol a megfelelő ellenanyag- mennyiséggel precipitátumot képez. Precipitációs gyűrű Antigén koncentráció

12 BSA koncentráció ( μg/ml) OVA MSA BSA MSA BSA immunizált nyúl szérum BSA és OVA immunizált nyúl szérum kicsapódott fehérje sávok Radiális kettős immundiffúzió (Ouchterlony módszer ) 1. Festés után:

13 Radiális kettős immundiffúzió Az antigénekről nem csak mennyiségi információt kaphatunk, hanem egyszerűbb jellemzést is (Ouchterlony módszer ) 2. poliklonális ellenanyagok A B B A A B A és B azonos A és B különböző A és B részben azonos

14 Immunelektroforézis polivalens immunszérum antiszérum szérumfehérjék + - Az immunprecipitáció (Nem klasszikus szerológiai reakció!!!) Az AG-EA kapcsolódást követően képződő oldott immunkomplexeket szilárd fázishoz kötött anti- immunglobulin vagy protein A/G bakteriális fehérjék segítségével oldhatatlan formában izolálják. A szilárd fázishoz kötött immunkomplexek további elúciós lépések eredményeként, oldott állapotban visszanyerhetők. (analóg az 1. gyak affinitás oszlopával)

15 Olcsó, megbízható diagnosztikus módszerek! Pl. gammopátiák diagnosztikája: M (mielóma) komponens kimutatása zónaelektroforézis és immunoelektroforézis segítségével Nagyméretű üveglemezre öntött immunelektroforézis gél: - 7 lukkal a minták és a standardok számára - 6 vájattal az immunszérumok számára

16 Rakéta elektroforézis (mennyiségi becsléshez) (gélben ellenanyag, lukakban antigén) standard sor minták 1.lépés: „zónaelektroforézis” 2.lépés: 90 o elforgatva immunelektroforézis az anti-szérumot pl. szűrőpapírba itatva fektetik a gélre

17 Agglutináció Direktsejtfelszíni antigénnel reagáló ellenanyagok kötődését követően a sejtek összecsapzódnak Indirekt Ha valamilyen okokból (pl. Ag determinánsok elrendeződése vagy a koncentráció viszonyok) nem jöhet létre a sejtek direkt agglutinációs összecsapódása, az antigénekhez kötött Ea-okat kötő második ellenanyag váltja ki az agglutinációt PasszívMérési/diagnosztikai céllal vörösvérsejtekhez vagy latex gyöngyökhöz mesterségesen antigének kapcsolhatók, és így az ezekre specifikus Ea-gal agglutináltathatók. A vörös- és fehérvérsejtek valamint baktériumok sejtfelszíni antigénjeivel reagáló ellenanyagok a sejtek összecsapódását, agglutinációját idézhetik elő. Nem oldott anyagok reagálnak az ellenanyagokkal, hanem mikroszkópos méretű struktúrák: pl. sejtek, latexgyöngyök, Az agglutinációnak szemmel látható eredménye van – nincs szükség komplikált kémiai reakciókra, drága enzimekre az elvégzéséhez

18 Diagnosztikus módszerként sok területen használják őket pl. AB0 vcs. Ag „inkomplett Ea” haptén v. Ag spec. Ea A direkt, indirekt és passzív hemagglutináció áttekintése szekunder Ea

19 Direkt agglutináció (pl. AB0 vércsoportok között) (animált ábra)

20 nincs agglutináció (animált ábra)

21 Indirekt agglutináció (klasszikus példa: Rh avagy D vércsoport meghatározáskor)

22 Passzív agglutináció 1. Az antigén specifikus ellenanyagok jelenléte kimutatható vele Pl. Reumatoid Artrítisz diagnosztikájánál (animált ábra)

23 Passzív agglutináció 2. az agglutináció gátlása szabad antigénnel - Egy ismeretlen mintában kimutatható az antigén jelenléte - Kisméretű, egyetlen antigén determinánssal rendelkező antigének agglutinációval történő kimutatása is lehetséges így (pl. haptének) Ha szabad antigén van jelen a mintában  nincs agglutináció (ismeretlen minta hozzáadása) pl.: Monoteszt terhesség kimutatási eljárás (animált ábra)

24 Hemagglutináció Ea-ok jelenléte nélkül? igen, virális fehérjékkel pl.: influenza, mumpsz vírus ellenes Ea kimutatása Az agglutinációt gátló ellenanyagok a receptorkötést is gátolják, tehát vírusneutralizáló sajátságúak (animált ábra)

25 Az Rhesus (Rh) vércsoportantigén (D) A struktúrája miatt az ellene termelődő IgG típusú ellenanyagok direkt agglutinációt nem tudnak kiváltani („inkomplett ellenanyag”) de emberi Ig-okkal reagáló 2. Ea-gal az agglutináció kiváltható indirekt agglutináció

26 Az agglutináció in vivo következményei ABO inkompatibilitásintravascularis haemolysis ( komplement mediálta hemolízis) Rh inkompatibilitáserythroblastosis fetalis ( vvt-ek opszonizálása, majd MØ –ok, granulociták általi fagocitózis) Rh profilaxis Ha az első Rh+ magzat születését követően 72 órán belül az anyai szervezetbe anti-D Ea-t juttatnak, megelőzhető az anyai ellenanyagok képződése.

27 Gyakorlati alkalmazás direkt agglutináció:ABO vércsoport meghatározás tiphoid láz kimutatása (Widal teszt – a baktérium agglutinációja az érintett személy szérumával) indirekt agglutináció:anti-D Ea jelenlétének kimutatása Coombs teszt passzív agglutináció:rheumatoid arthritis kimutatása

28 Az antigén-ellenanyag arány hatása az agglutinációra

29 Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y komplementek a humán szérumban növekvő mennyiségű humán szérum Szérum komplement aktivitás titrálása hemolízis

30 hőinaktivált humán szérum Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y KONTROLL KÍSÉRLETEK fiziológiás sóoldat desztillált víz Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y ozmolízis Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y

31 növekvő mennyiségű felülúszó Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y YY Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y 1 2 Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y csökkenő mennyiségű anti-BSA ellenanyag Y komplement a humán szérumban BSA anti-BSA ellenanyag KOMPLEMENT KIMERÍTÉS növekvő mennyiségű felülúszó növekvő mennyiségű felülúszó

32 Makrofágok mononukleáris fagocitarendszer sejtjei differenciálódás, aktiválódás során: - adherencia nő, - migrációs képesség nő, - gyulladási mediátorok szekréciója nő, - Ag-felvétel, feldolgozás T-sejt aktiváló képesség fokozódik, hatékonyabb fagocitáló- és mikrobaölő képesség. FAGOCITÓZIS Toll-like receptorok mannóz-receptorok scavanger-receptorok opszonozáció: ellenanyag és komplementkomponensek jelenlétében, Fc és komplement- receptorok révén aktivált MF-ok (LPS, IFNg) MIKROBAÖLÉS intracelluláris kórokozók eliminálása ROI, RNI (NO, ONOO-) MF kétlépcsős aktivációja szükséges Griess-Ilosvay reakció: NO2- (nitrit)

33 A MAKROFÁGOK RECEPTORAI, SEJTFELSZÍNI MOLEKULÁI LPS receptor (CD14) + TLR4 MHCI MHCII TLR – patogén mintázatok CR1 (CD35) CR3 (CD11b/CD18) LFA1 (CD11a/CD18) Fc  RIII (CD16) Fc  RII (CD32) Fc  RI (CD64) Ag + IgG Komplex Mannóz receptor Scavanger receptor peroxidáz hidroláz

34 Az immunkomplexek mérete és az effektor funkciók hatékonysága Kisméretű immunkomplexA fagocita Fc receptorainak nem elég nagy az affinitása a magányos ellenanyag iránt Nagyméretű immunkomplex Makrofág F a g o c i t a r e c e p t o r o k A nagyméretű immunkomplex egyszerre több Fc receptorral képesek kapcsolódni, így a kölcsönhatások össz aviditása már elegendő az effektor funkciók elindításához

35 Fagocitózis A mikróbák a fagociták receptoraihoz kötődnek A fagocita membrán körülöleli a mikróbát A mikróba a fagoszómába záródik Antitesttel opszonizált mikróba Mannóz receptor Mac-1 integrin Scavenger-receptor Lizoszóma Fagoszóma A mikróba elpusztítása A lizoszóma a fagoszómával egyesül, és a mikróba elpusztul

36 Baktériumok elpusztítása a sejtben Sejten kívüli baktériumölés Baktériumölés a fagolizoszómákban, lizoszomális enzimekkel Bekebelezett bak- tériumok ölése oxi- géngyökök és NO segítségével

37 NO mérés: vizeletből, szérumból (klinikum) Gries-Ilosvay (nitrit ill. nitrát visszaredukálása NO-vá), Argini –Citrulin átalakulás mérése, iNOS kimutatása (IHC, Western blot), Termelődő NO mérés DAF-fal (fluoreszcens), NO szenzor Makrofág funkciók vizsgálata Antigén felvétel/fagocitózis vizsgálata: élesztők, fluorescens beadek etetése makrofágokkal, elő-opszonizált FITC jelölt E. coli fagocitózisa (FACS) Citokin mérés: TNF , TGF  Reaktív oxigéngyökök meghatározása: NBT teszt Hidrogén peroxid assay Citokróm c assay


Letölteni ppt "IMMUNKOMPLEXEK KIALAKULÁSA, SZEROLÓGIAI REAKCIÓK (KOMPLEMENT-MEDIÁLT LÍZIS, PRECIPITÁCIÓ, AGGLUTINÁCIÓ) - Régi, megbízható módszerek - sok közülük most."

Hasonló előadás


Google Hirdetések