Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

1 IMMUNSZEROLÓGIA, AGGLUTINÁCIÓ, PRECIPITÁCIÓ (ÁOK 2012) Rövid tartalom: Immunszerológiai módszerek Immunkomplexek túltermelődésével járó kórképek.

Hasonló előadás


Az előadások a következő témára: "1 IMMUNSZEROLÓGIA, AGGLUTINÁCIÓ, PRECIPITÁCIÓ (ÁOK 2012) Rövid tartalom: Immunszerológiai módszerek Immunkomplexek túltermelődésével járó kórképek."— Előadás másolata:

1 1 IMMUNSZEROLÓGIA, AGGLUTINÁCIÓ, PRECIPITÁCIÓ (ÁOK 2012) Rövid tartalom: Immunszerológiai módszerek Immunkomplexek túltermelődésével járó kórképek

2 2 Agglutináció és precipitáció agglutináció precipitáció, immunkomplex képződés

3 3 Antigén- antitest kapcsolat (nem kovalens)

4 4 Immunkomplex és precipitátum Az antigénnek az ellenanyaggal alkotott (oldható) komplexei. A komplexképződés pillanatszerűen is lejátszódhat, egyensúlyra vezető folyamat. Nem azonos a precipitátummal! A precipitátum az immunkomplexekből fizikai-kémiai folyamatok során keletkező oldhatatlan csapadékot jelenti. Időigényes folyamat. antitest antigén

5

6 6 Gyűrű precipitáció

7 7 -valencia (kapcsolatteremtő képesség) -hőmérséklet (37 о C ; 4 о C ) - pH - sókoncentráció - idő - egyéb (pl. PEG) Ekvivalenciát befolyásoló tényezők: IgM-pentamerIgA-dimer Oldékonyságot csökkenti, kedvez a csapadék-képződésnek

8 8 MÓDSZEREK Immundiffúzió: (agargélben, antigén, antitest precipitációs reakcióján alapul) - radiális egyszerű (ellenanyagot vagy antigént keverik a gélbe) - radiális kettős (mindkét komponens diffundál a gélben) Elektroforézis: - immunoelektroforézis (többkomponensű antigént elektroforetizálják, majd polivalens ellenszérummal reagáltatják.) - rakéta elektroforézis (ellenanyagot gélbe keverik, antigént elektroforetizálják) - két-dimenziós elektroforézis (elektroforetikus tulajdonságok alapján szétválasztott antigén frakciókat ellenanyag tartalmú gélen újra elektroforetizálják) Turbidimetria (a fényszórással arányos fényintenzitás csökkenését méri) Nefelometria (a szórt fény intenzitását méri)

9 9 Immundiffúziós módszerek poliklonális ellenanyag agaróz gélbe keverve Meghatározandó antigén az agarózba vájt lyukakban pl. immunglobulin meghatározásra használható az antigén és az ellenanyag találkozása precipitációs ív kialakulását eredményezi

10 10 Mancini-módszer

11 11 Antigén koncentráció meghatározása Mancini módszerrel Antigént tartalmazó lyuktól való távolság Az optimális arányt adó antigén koncentráció. IgG koncentráció mérése szérumból radiális immundiffúzióval. A standardok átmérője lehetővé teszi a kalibrációs görbe megrajzolását. A vizsgált szérum minta IgG koncentrációja a görbéről leolvasható: - T1 – IgG mielómás beteg szérumából; 15 mg/ml - T2 – hipogammaglobulinémiás beteg széruma; 2,6 mg/ml - T3 – normál szérum; 9,6 mg/ml Átmérő négyzete IgG koncentráció (mg/ml) Radiális immundiffúzió: az antigén koncentráció és a precipitációs gyűrű méretének kapcsolata. A nagyobb koncentrációjú antigén (Ag1) a lyuktól messzebbre vándorolva éri el azt az egyensúlyi állapotot, ahol a megfelelő ellenanyag- mennyiséggel precipitátumot képez. Precipitációs gyűrű Antigén koncentráció

12 12 Radiális kettős immundiffúzió Immundiffúziós módszerek Antigének közös determinánsainak vizsgálata Az antigént tartalmazó lyuktól egyenlő távolságra elhelyezett ellenanyagok különböző koncentrációban. Az antigén és az ellenananyag találkozása precipitációs ív kialakulását eredményezi, ebből az ellenanyag koncentrációra következtethetünk. Fordítva, az antigén koncentráció meghatározására is alkalmas a módszer.

13 13 Szérum elektroforézis

14 Mi a különbség a plazma és a szérum között?

15 15 Szérum elektroforézis

16 16 Gamma-globulinok relatív túlsúlya Poliklonális gammopátiák esetében a gamma-globulinok relatív arány megnövekszik, kiemelkedő hegyes csúcs (M-spike) nélkül. Krónikus májbetegségben nem gamma-globulinok mennyisége több, hanem az egyéb plazma fehérjék termelődnek kisebb mennyiségben. A gamma-globulink ténylegesen emelkedettek lehetnek krónikus gyulladás (SBE: subacute bacterial endocarditis, fertőzés (pl. AIDS) esetén vagy autoimmun betegségekben.

17 17 Hegyes csúcs (M-spike) a gamma régióban monoklonális gammopátiára utalhat, gyakran plazma sejtes myeloma okozza. A többi gamma fehérje és albumin általában csökkent. Monoklonális gammopatiák

18 18 Szérum elektroforézis Napi rutinban alkalmazzuk, különösen fontos magas szérum összfehérje szint esetén. Eset: 80 éves nő, fő panasza igen heves derékfájdalom. Laborok: We:130 (normál<20); CRP:4 (normál <5), osteoporosis nincs. LS gerinc RTG felvételen kompresszió látható. Hematológiai vizsgálat, (további labor és csontvelő vizsgálatok): diagnosis: myeloma multiplex. A beteg kezelést megelőző és 9 hónapos kezelést követő görbéje M komponens redukció jól látható. kezelés előttkezelés után

19 19 Immunelektroforézis Agargélben végzett elektroforézis és kettős immundiffúzió kombinációja.

20 20 Immunelektroforézis polivalens immunszérum antiszérum szérumfehérjék - +

21 21 Ember (A), egér (B) és patkány (C) szérumának vizsgálata elektroforézissel ember egér patkány

22 22 Immunelektroforézis KontrolBeteg

23 23 Immunelektroforézis KontrolBeteg

24 24 Immunelektroforézis

25 25 Rakétaelektroforézis A precipitációs terület (közelítőleg a csúcsok magassága) arányos az antigén (Ag) koncentrációjával.

26 Immunfixáció koncentrált vizeletminták Az eljárás menete: elektroforézis – immunfixáció (inkubálás antiszérummal) - mosás - szárítás – mosás – festés – mosás - szárítás. A napi rutin részét képezi az immunlaborokban.

27 27 Immunfixáció denzitometriás értékeléssel egészséges monoklonális gammopathia

28 28 Turbidimetria és nefelometria Turbidimetria: (érzékenység: 50 µg/ml) szérumban, liquorban nagy mennyiségben jelen lévő fehérjék vizsgálata. Fényintenzitás csökkenést mérjük. Nefelometria: (érzékenység: 1 µg/ml) kis koncentrációjú szérum és liquor fehérjék, gyógyszer szintek mérése. A szórt fény intenzitását méri. Mindkét módszer szolubilis fehérjék vizsgálatára alkalmas, napi rutinban elterjedt. Vizsgálandó antigénre specifikus antitest és az antigén által létrehozott immunkomplex fényszórásán alapul mindkét módszer.

29 29 Szerológiai módszerek alkalmazása Immundiffúzió: pl: bakteriális, virális és gomba antigének jellemzésére - radiális egyszerű (Mancini-módszer): antigének mennyiségének összehasonlító vizsgálata, szérum fehérjék ( immunoglobulin izotípusok [IgM, IgG, IgA], akut fázis fehérjék, transzferrin, komplement komponensek) mennyiségi meghatározása különböző testfolyadékokban, ellenanyagok mennyiségi meghatározása - radiális kettős (Ouchterlony módszer): precipitációs ekvivalencia zóna becslése, precipitáló ellenanyagok relatív szintjének (titerének) meghatározása, állandó ellenanyag koncentráció mellett az antigén mennyisége is megbecsülhető Elektroforézis: - immunoelektroforézis, immunfixáció: szérum fehérjék frakciókra való elválasztása, plazmasejt rendellenesség (myeloma multiplex, elsődleges amiloidózis) során képződő, monoklonális eredetű immunoglobulinok kimutatása - rakéta elektroforézis: antigén/ellenanyag koncentráció meghatározása - két-dimenziós elektroforézis: elektroforetikus mobilitás alapján szétválasztott frakciók (pl: szérum fehérjék) koncentrációjának meghatározása, szérum, vizelet, cerebrospinális folyadék fehérje összetételének kvantitatív és kvalitatív vizsgálata. Turbidimetria és nefelometria: nagyérzékenységű módszerek oldott fehérjék mérésére.

30 Immunprecipitáció Az antigén-ellenanyag kapcsolódást követően (2) képződő oldott immunkomplexeket szilárd fázishoz kötött anti- immunglobulin vagy protein A/G bakteriális fehérjék (3) segítségével oldhatatlan formában izolálják (4). A szilárd fázishoz kötött immunkomplexek további elúciós lépések eredményeként, oldott állapotban visszanyerhetők.

31 Egy adott betegség diagnózisában a különböző módszereket kombináljuk: pl. Myeloma multiplex

32 32 Proteinek detektálására szolgáló további módszerek: Western blot, immunprecipit áció és ELISA (Lásd korábbi gyakorlaton!)

33 Immunkomplex túltermelődésével járó kórképek

34 34

35 35 FcγRIIIa mutáció: IgG1, IgG3 – IC clearance lupus nephritis Csökkent immunkomplex clearance szerepe SLE-ben immunkomplex (IC): komplement klasszikus út aktiváció FcγRIIa mutáció: IgG2 kötés – gyengébb IC clearance lupus nephritis Antigen

36 Szérum betegség A szérumbetegség az immunrendszer reakciója a véráramot elárasztó nagy mennyiségű idegen fehérje ellen. Ezen fehérjék egyik leggyakoribb forrása a ló eredetű vérszérum, mely sok olyan ellenméregnek (antidótumnak) összetevője, melyeket mérges kígyók harapása vagy mérges pókok vagy skorpiók csípése esetén alkalmaznak. A szérumbetegség tünetei közé sorolható a láz, a kiütés és az ízületi fájdalmak (III. típusú hiperszenzitivitás). Ritkán veseelégtelenség és halál is előfordul. Az orvos antihisztaminnal (például difenhidraminnal) és kortikoszteroiddal kezeli a szérumbetegséget.

37 Natural history of acute serum sickness in rabbits following a single injection of radiolabelled bovine serum albumin (BSA) as antigen. The disease occurs when large quantities of soluble immune complexes are present in the circulation. From Rich RR (1992) Immune complex diseases. In: Wyngaarden JB, Smith LH Jr and Bennett JC (eds), Cecil's Textbook of Medicine, 19th edn, pp. 1467–1470. Philadelphia: WB Saunders. Fever,

38 Agglutináció

39 39 Agglutináció típusai, gyakorlati alkalmazás A vörös- és fehérvérsejtek valamint baktériumok sejtfelszíni antigénjeivel (legalább mikroszkópikus méretű antigének) reagáló ellenanyagok a sejtek összeállását, agglutinációját idézhetik elő. Fajtái: direkt: Ellenanyagok kötődését az antigénhez a sejtek összecsapódása kíséri (pl. AB0 vércsoport antigének) - főleg IgM indirekt : Az antigén determinánsok elrendeződése nem teszi lehetővé az direkt összecsapódást. DE! A sejtek összecsapódása a kötött ellenanyagok Fc részéhez kötődő második ellenanyaggal kiváltható (pl. D vércsoport antigén(Rh)) (IgG) passzív: Megfelelően kezelt vörösvértestekhez vagy latex részecskékhez haptének vagy antigének kapcsolhatók, és ezekre specifikus ellenanyaggal agglutinálhatók (rheumatiod arthritis). A szérumban a saját IgG-vel reagáló IgM és IgG autoellenanyagok (RF) jelennek meg.

40 40 - reakció gyors ülepedés - reakció gyors ülepedés + reakció lassú ülepedés Az antigén-ellenanyag arány hatása a hemagglutinációra

41 41 IgM a leghatékonyabb agglutinin

42 42 Direkt agglutináció pl. AB0 vércsoport meghatározás ellenanyag (antitest) vörös- vértest

43 43 Vörösvértestek hemagglutinációja 1-9- anti birka VVT antitest hígitási sor; kontroll

44 44 Az ABO vércsoportantigének szerkezete A fenotípusok kialakulását kodominánsan öröklődő specifikus enzimek irányítják. O ANTIGÉNA ANTIGÉNB ANTIGÉN SZÉNHIDRÁT TÍPUSÚ ANTIGÉNEK

45 45 Donorválasztás az ABO-vércsoport antigének alapján Ma már csak elvi lehetőség, rutinban kizárólag csoportazonos (AB0 és Rh) vér transzfundálható!

46 46 Indirekt agglutináció pl. Rh vércsoport meghatározás

47 47 Vércsoport meghatározás Hagyományos csempés meghatározásMicroplate-s meghatározás Mikrooszlopos technika Ágy melletti gyorsteszt

48 48 A Rhesus (Rh) vércsoportantigén (D) IgG típusú ellenanyag direkt agglutinációt nem vált ki (inkomplett ellenanyag), de emberi immunglobulinokkal reagáló 2. ellenanyaggal az agglutináció kiváltható indirekt agglutináció FEHÉRJE ANTIGÉN citoplazmamembrán extracelluláris tér intracelluláris tér

49 49 Az agglutináció in vivo következményei ABO inkompatibilitásintravascularis haemolysis ( komplement mediálta hemolízis) Rh inkompatibilitáserythroblastosis fetalis ( vvt-ek opszonizálása, majd MF –ok, granulociták általi fagocitózis) Rh profilaxis Ha az első Rh+ magzat születését követően 72 órán belül az anyai szervezetbe anti-D ea-t juttatnak, megelőzhető az anyai ellenanyagok képződése.

50 50 Passzív agglutináció CRP latex gyorsteszt Rheumatoid faktor latex teszt (Lásd Autoantitestek vizsgálata c.prezentációban.) HCG latex teszt

51 51 Passzív agglutináció (diagnosztikai/indikátor módszer) Rheumatoid arthiritis: a szérumban a saját IgG-vel reagáló IgM autoellenanyagok (RF) jelennek meg. RF: rheumatoid faktor Latex Antigén

52 52 Hemagglutináció ellenanyagok jelenléte nélkül? Virális fehérjékkel pl.: influenza, mumpsz pl. vírus ellenes ellenanyagok kimutatása Az agglutinációt gátló ellenanyagok a receptor kötést (sziálsav) is gátolják, tehát vírusneutralizáló sajátságúak (Nem immunológiai reakció!!!)

53 53 Gyakorlati alkalmazás direkt agglutináció:pl. ABO vércsoport meghatározás tiphoid láz kimutatása Widal teszt (baktériumokat agglutinál a páciens széruma) indirekt agglutináció:pl. anti-D Ea jelenlétének kimutatása * Coombs teszt passzív agglutináció:pl. rheumatoid faktor kimutatása * *További részletek későbbi gyakorlatokon (hiperszenzitivitás, autoantitestek kimutatása)!

54 54 Az agglutináció in vivo következményei ABO inkompatibilitásintravascularis haemolysis ( komplement mediálta hemolízis) Rh inkompatibilitáserythroblastosis fetalis ( vvt-ek opszonizálása, majd MF –ok, granulociták általi fagocitózis)

55 55 Immunkomplex túltermelődésével járó kórképek (összefoglalás) Saját antitestek –Hyperszenzitivitás II. ABO inkompatibilitás RH inkompatibilitás Hemolitikus anemia –Hiperszenzitivitás III. SLE Idegen antitestek –Passzív immunizálás: szérumbetegség (Hiperszenzitivitás III.)

56 Irodalom Fülöp A. K. (Szerk.): Immunológiai szemináriumok, 3. fejezet. Következő hét: Sejttenyésztés Fülöp A. K (Szerk.): Immunológiai szemináriumok, 5. fejezet.


Letölteni ppt "1 IMMUNSZEROLÓGIA, AGGLUTINÁCIÓ, PRECIPITÁCIÓ (ÁOK 2012) Rövid tartalom: Immunszerológiai módszerek Immunkomplexek túltermelődésével járó kórképek."

Hasonló előadás


Google Hirdetések