Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

 Aktív formában termeltetni a fehérjét, ahogy in vivo előfordul, szekretáltatni, hogy a diszulfid hidak kialakuljanak  ha a fehérje mérgező a gazdasejtre,

Hasonló előadás


Az előadások a következő témára: " Aktív formában termeltetni a fehérjét, ahogy in vivo előfordul, szekretáltatni, hogy a diszulfid hidak kialakuljanak  ha a fehérje mérgező a gazdasejtre,"— Előadás másolata:

1  Aktív formában termeltetni a fehérjét, ahogy in vivo előfordul, szekretáltatni, hogy a diszulfid hidak kialakuljanak  ha a fehérje mérgező a gazdasejtre, akkor először inaktív fehérjét állítunk elő, majd ezt aktiváljuk, ehhez kell az in vitro “refolding” Két fő stratégia: Az aktív forma esetén “csak” tisztítani kell a fehérjét Rekombináns fehérjék termeltetési stratégiái

2 Három fő lépés: 1. Az oldhatatlan “inclusion body”-t szolubilizáljuk, alacsony vagy magas pH, emelt hőmérséklet, detergensek, magas koncentrációjú szervetlen sók, vagy szerves oldószerek. A legelterjedtebbek: urea, vagy guanidin-hidroklorid, esetleg redukálószer (pl. DTT) jelenlétében. 2. Refolding híg fehérje oldattal - ha nincs diszulfid híd, akkor a fehérje denaturálószer lassú eltávolítása - ha diszulfid hidak vannak, akkor a renaturáció mellett a diszulfid hidakat is ki kell alakítani, szerkezet stabilizáló hatásuk van. levegőztetés, tiol-diszulfid párok hozzáadása, pH optimalizálása 3. Az aktív és inaktív forma szétválasztása pl. affinittás kromatográfia, preparatív SDS-PAGE, RP-HPLC, FPLC stb. REKOMBINÁNS FEHÉRJÉK AKTÍV FORMÁBA VITELE

3 trp promoter alapú vektorok - alaposan vizsgált, jósolható eredmény - erős, 2-30% a rekombináns/összfehérje - alapállapotban alacsony expresszió, de toxikus fehérjékre ez nem elég, pBR322 vektorban kb 50x-es indukció - majdnem minden E. coli sejtvonalban használható - magas kópiaszámú plazmidok nem használhatók, nincs elég trp represszor Probléma: triptofán elvonás az indukció – egy kissé nehézkes

4 Kétkomponensű trp alapú expressziós rendszer Invitrogen p trp cI Kromoszómán integrálva

5 T7 RNS polimeráz alapú vektorok - T7 promoter nagyon szelektív, a gazdában nincs ilyen promoter általában - T7 RNS polimeráz 5x gyorsabb, mint az E. coli-é, azaz már a transzkript is domináns Gazdasejtek: Standard klónozó vektorok klónozásra BL21 (F-, ompT-, lon-) expresszióra, lizogén sejtváltozatok: DE3 bakteriofág, immunitási régió, lacI gén, lacUV5 promoter lacZ eleje + T7 RNS polimeráz génje, integrálva kromoszómába Nagyon toxikus fehérjék esetén pLysS, pLysE T7 lizozim: természetes inhibitora a T7 RNS polimeráznak, E. coli tudja tolerálni, mert nem képes áthatolni a belső membránon pACYC184 vektorba van beépítve, cat r, kompatibilis vektor pLysE nagy mennyiséget, pLysS kevesebb mennyiséget termel (ellentétes orientáció, tet promoter CE6 bakteriofág tartalmazza a T7 RNS polimeráz génjét, így az indukció kívülről bejuttatott gén

6 kromoszóma lacI lacUV5 lacZT7 RNS polimerázint vektor Prom.RBS  10 vagy T7/lac termeltetendõ fehérje génje ORIbla A pET vektorokon alapuló, indukálható fehérje termelés elvi sémája

7 A pET rendszer

8 pET vektorok  pBR322 származékok,  ampicillin, vagy kanamicin rezisztensek   10 promoter, a T7 fág  10-es génjének (kapszid) erős promótere T7 promoter van, de nincs transzlációs iniciációs szignál különféle verziók, stop szignálok bevitele vagy sem, fúziós partner esetleg a C terminálison Visszaszorulóban vannak 1. Transzkripciós vektorok Nagyon toxikus fehérjék esetén dupla biztosítás: a T7 promotertől startpont környékére a lac operátor szekvencia klónozása, elegendő lacI biztosítása, a vektorba beépítették ellentétes irányban T7lac promoteres változatok

9 Két transzkripciós vektor példa

10   10 transzkripciós és transzlációs szignálok,  mindegyik típusú egy sorozat különböző leolvasási keretekkel  Egy rövid fúzió az első 10 aminosavval (g10), de NdeI-gyel elkerülhető.  Esetenk ént  206aa fúzió  stabilitás Transzlációs vektorok

11

12

13 lemezek: ampicillin, IPTG, mindkettő és egyik sem Mik nőnek fel? 1. egyik sem: minden sejt 2. ampicillin: plazmid tartalmú sejtek, 3. IPTG: plazmid mentes sejtek, vagy expressziós mutánsok 4. IPTG, amp.: plazmid marad, de az expressziós készség elveszett Plazmid stabilitási teszt

14 p tac alapú vektorok: pGEX sorozat GST: mindig N-terminális fúzió elvileg szolubilizál Nem lehet denaturáltan tisztítani

15 Szekréciós vektor Szabályozás Kontrollálhatóság Vektor felépítés Arabinóz alapú expressziós vektorok

16 Fehérje termeltetés in vitro In vitro transzláció Előnyei:  Oxidatív környezet  Citotoxicitás elkerülése, farmakológiai alkalmazások  Nincs membrán, a termék azonnal a reaktortérbe kerül  gyors Hátrányai:  Drága  Kitermelés korlátozott Két fő stratégia RNS polimerázzal +sejt extraktummal Tiszta komponensekből

17 Az in vitro fehérjetermeltetés folyamatábrája

18 T7 alapú rendszerek

19 Az igazán in vitro rendszer

20 ATGGAACGCCGCTATTGCCATCGCATTAGCACCATGGCGAG CGCGAACGATCATGCGCCGCCGTATAACGAATGGTATGAA GCGCGCTAA

21 1 atggaacgccgctattgccatcgcattagcaccatggcgagc m e r r y c h r i s t m a s gcgaacgat a n d catgcgccgccgtataacgaatggtatgaagcgcgctaa h a p p y n e w y e a r - MERRY CHRISTMAS AND HAPPY NEW YEAR

22


Letölteni ppt " Aktív formában termeltetni a fehérjét, ahogy in vivo előfordul, szekretáltatni, hogy a diszulfid hidak kialakuljanak  ha a fehérje mérgező a gazdasejtre,"

Hasonló előadás


Google Hirdetések