Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

A génaktivitás szabályozása. Nem minden gén nyilvánul meg állandóan Sejt típusa (egérben ~200), sejtciklus állapota Minden sejttípusban ugyanaz a genetikai.

Hasonló előadás


Az előadások a következő témára: "A génaktivitás szabályozása. Nem minden gén nyilvánul meg állandóan Sejt típusa (egérben ~200), sejtciklus állapota Minden sejttípusban ugyanaz a genetikai."— Előadás másolata:

1 A génaktivitás szabályozása

2 Nem minden gén nyilvánul meg állandóan Sejt típusa (egérben ~200), sejtciklus állapota Minden sejttípusban ugyanaz a genetikai állomány (kevés kivétellel) Egy bizonyos géntermék szintézisét génszabályozási mechanizmusok ellenőrzik A génaktivititást a transzkripció szinten –Szignálok kívülről, vagy sejten belülről –Ha kell ki/bekapcsolás

3 A génexpresszió ellenőrzési pontjai DNS átrendeződés – DNS szekvencia helye a genomban Transzkripciós szabályozás – RNS szintézis iniciáció/termináció RNS processzálás – splicing/alternatív splicing Transzlációs szabályozás mRNS stabilitás Poszttranszlációs szabályozás – enzimaktivitás, aktiválás, stabilitás, stb.

4 Prokarióták vs eukarióták Prokarióták – maximális növekedés az adott körülmények között, kivéve, ha végzetes Transzkripció és transzláció egyszerre, egy helyen (splicing nem) Eukarióták – egyedfejlődés, osztódás és specializálódás Felnőttben – fenntartás, tápanyagok nem változnak olyan drasztikusan

5 Transzkripció szabályozása prokariótákban Gyakran ki/be, csak akkor,ha a géntermék kell (A Ki leggyakrabban nagyon kicsi expressziót jelent (eukariótákban az egyedfejlődésnél)) Koordinált szabályozás – egy, vagy több metabolizmus útvonal génjei együtt, policisztronos mRNS (eukarióta monocisztronos)

6 Katabolizmus útvonalak (degradatív) Indukálható, kis inducer molekula Anabolikus útvonalak (bioszintézis) Végtermék elég, represszálható enzimszintézis, kis korepresszor molekula

7 Két fő kategória: negatív, pozitív szabályozás

8 Indukálható rendszer: –Negatív szabályozás: a represszor fehérje megakadályozza a transzkripciót; az inducer antagonizálja a represszort; van transzkripció Represszálható rendszer: aporepresszor+korepresszor=funkcionális represszor nincs transzkripció Pozitív szabályozás: mRNS csak akkor, ha transzkripciós aktivátor kapcsolódik az aktiválandó gén megfelelő régiójához Autoreguláció: fehérje a saját génjét +/-

9 Laktóz metabolizmus és az operon E. coli laktóz hasznosítás szabályozásának genetikai analízise –Lac - mutánsok Két gén - β-galaktozidáz, laktóz permeáz – szükséges Néhány száz Lac - mutáns: kromoszómán és F’lac-on F’×F - mating = parciális diploidok; F’ lac - / lac + és F’ lac + / lac - = mind Lac + F’ lac - × lac - → Lac + fenotípusra szelektálva 2 komplementációs csoport, legalább két gén (lacZ, lacY), legalább két gén! (LacA laktóz transzacetiláz később, mert nem esszenciális a laktóz hasznosításhoz.)

10 F’lacY - lacZ + /lacY + lacZ - és F’lacY +l acZ - /lacY - lacZ + → Lac + fenotípus F’lacY -l aZ + /lacY - lacZ + és F’lacY + lacZ - /lacY + lacZ - → Lac - fenotípus lacZ → β-galaktozidáz lacY → laktóz permeáz lacZ és lacY nagyon közel, kotranszdukcióval térképezve

11 Génexpresszió baktériumokban – néhány fontos megkülönböztetés: Szabályozott gének Sejt növekedés és sejtosztódás szabályozása. Megnyilvánulásukat (expresszió) a sejt szükségletei és a környezet szabályozzák, szükség szerint, nem folyamatosan működnek. Konstitutív gének Folyamatosan kifejeződnek. Háztartási gének (housekeeping genes), mint pl. a fehérjeszintézishez és a glükóz metabolizmushoz szükséges gének. *Valamelyik szinten minden gén szabályozott!

12 Operon – mi az? Gének csoportja (cluster), amelyeknek expresszióját operátor-represszor fehérje kölcsönhatás szabályozza, operátor régió és a promóter. Egy operon részei: Promóter Represszor Operator (ellenőrző hely) Kódoló szekvenciák (gének, cisztronok, ORF-ek) Terminátor Egymás melleti kódoló szekvenciák (pl., baktériumok, mtDNS) együtt íródnak át poligénes (policisztronos) mRNS-sé.

13 Inducer és indukció: Inducer = kémiai, vagy környezeti ágens, ami egy operon transzkripcióját iniciálja. Indukció = géntermék(ek) szintézise az inducerre adott válaszként.

14 Operon szerveződése

15 E. coli lac operonja: Az E. coli a glükóz metabolizmus géneket folyamatosan kifejezi (konstitutív gének). Az alternatív cukorok (pl. laktóz) metabolizmusa specifikusan szabályozott. laktóz = diszaccharid (glükóz + galaktóz), energia forrás. A laktóz inducer (efektor molekula), három fehérje termelését az 1000-szeresére növeli: -galaktozidáz (lacZ) A laktózt glükózra + galaktózra hidrolizálja. A laktózt allolaktózzá alakítja, ez regulálja a lac operont. Laktóz permeáz (lacY) Laktóz transzport a citoplazma membránon. Transzacetiláz (lacA) A többi szacharidot acetilezi.

16 Az E. coli lac operon: Francois Jacob és Jacques Monod Két különböző mutáció típust vizsgáltak a lac operonban: 1.Mutációk a fehérje-kódoló génszekvenciákban. 2.Mutációk a szabályozó szekvenciákban.

17 1.Fehérje kódoló gének szekvenciáiban mutánsokkal térképezték a géneket: 2.lacZ (-galaktozidáz) knock-out mutánsok (funkció vesztés) gátolják a laktóz permeáz (lacY) és a transzacetiláz (lacA) funkciókat. 3.lacY (laktóz permeáz) knock-out mutánsok gátolják a transzacetiláz (lacA) funkciót, de nincsenek hatással a - galaktozidázra (lacZ). 4.lacA (transzacetiláz) knock-out mutánsok sem a -galaktozidázt (lacZ) sem pedig a laktóz permeázt (lacY) nem befolyásolják. Következtetés: a 3 lac operon gén a következő sorrendben kapcsolt: 1.lacZ 2.lacY 3.lacA

18 A lac operon transzlációja vad típusú és mutáns E. coli-ban.

19 2. A gén-megnyilvánulást befolyásoló mutációk a regulátor szekvenciákban: Jacob és Monod olyan mutánsokat is vizsgált, amelyek annak függvényében termelték a lac operon fehérjéit, hogy jelen volt-e az inducer laktóz: 2 típusú upstream lac regulátor mutánst jósoltak meg: 1.Mutációk a lac operátorban (lacO) 1.Mutációk a lac represszorban (lacI)

20 Mutációk a lac operátorban (lacO): Parciális diploid E. coli törzseket használtak: lac operon gének normális promóterrel a plazmidon (F’). Plazmid F’lacO + lacZ - lacY +  permeáz (csak laktózzal) Kromoszóma ClacO c lacZ + lacY -  -galaktozidáz (laktóz nélkül is) (folyamatosan megnyilvánul, konstitutív) Következtetések: 1.A lacO a lacZ és a lacY előtt helyezkedik el és az utána következő fehérjék termelését befolyásolja ugyanazon a molekulán. 2.A lacO egy szabályozó DNS szekvencia; nincs diffúzóra képes géntermék. 3.Ha lenne diffúzióra képes géntermék, akkor laktóz nélkül is termelődne permeáz.

21 Mutációk a lac represszorban (lacI): Szintén parciális diploid E. coli F’ törzsekkel; lac operon gének normális promóterrel és normális operátorral. F’lac I+lacO+lacZ-lacY+ ClacI-lacO+lacZ+lacY- Laktóz nélkül, nincs -galaktozidáz és permeáz termelés. Laktózzal (inducer), -galaktozidáz és permeáz szintetizálódnak. Következtetés: 1.lacI+ represszor fehérjét kódol (diffúzióra képes termék). 2.Laktóz nélkül a represszor fehérje kötődik az operátorhoz és gátolja a downstream fehérjék termelődését. 3.Laktóz jelenlétében a represszor fehérjét gátolja az allolaktóz és a fehérjék termelődnek.

22 Mutáció lehet a promóterben is (P lac ): Gátlódhat az RNS polimeráz kötődése és nincs fehérje szintézis a struktúrgénekről, ha van laktóz, ha nincs. Egyetlen mutáció mindhárom fehérje génjét befolyásolja, lacZ, lacY, és lacA.

23 A lac operon szerveződése a vad típusú E. coli-ban. A szabályozó elemek és a gének sorrendje: lacI: promóter-lacI-terminátor operon: promóter-operátor-lacZ-lacY-lacA-terminátor

24 Az E. coli lac operon funkcionális állapota laktóz nélkül:

25 Az E. coli lac operon funkcionális állapota laktózon növesztve :

26 A lac represszor modellje tetramer (4 polipetid) fehérje.

27 A Jacob-Monod féle E. coli lac operon modell: 1.Az operon egy génklaszter; a gének megnyilvánulásást opero- represszor kölcsönhatás szabályozza. 2.A lac I génnek van saját gyenge promótere és terminátora; lacI represszor fehérje mindig van kis mennyiségben. A represszor fehérje tetramer (4 polipeptid). A represszor kötődik az operátorhoz (lacO) és akadályozza az RNS polimerázt a transzkripció iniciációjában. A kötődés reverzibilis, így mindig van kevés LacZ, LacY, és LacA fehérje. Amint nagy mennyiségű laktóz kerül a tápoldatba a lac operon azonnal bekapcsol. 3.A laktózon növekvő vad típusú E. coli-ban a  -galaktozidáz a laktózt átalakítja allolaktózzá. Az allolaktóz kapcsolódik a represszorhoz, ezért a represszor fehérje alakja megváltozik és nem tud kötődni az operátorhoz. Az allolaktóz indukálja a lac operon expresszióját.

28 4.Az RNS polimeráz egyetlen poligénes mRNS szintézisét iniciálja, a lacZ, lacY, és lacA gének mRNS-ét. 5.mRNS egyetlen molekulaként transzálódik riboszóma füzérrel. 6.A lac operon úgynevezett negatív kontroll alatt áll (a lacI blokkolja az RNS polimerázt, ha nincs indukáló ágens) 7.Különböző típusú mutációk lehetnek a lacO, alacI, és a promóter régiókban: lacO-megváltozik a represszor kötőhelye (represszor nem tud kötődni) -állandó, konstitutív exszpresszió lacI-a represszor konformáció változik meg (nem tud kötődni az operátorhoz) -konstitutív -szuper-represszor köti az operátort, de az allolaktózt nem -a laktóz nem tudja indukálni az operont, nincs expresszió promóter-megváltozik affinitása az RNS polimerázhoz -növeli, vagy csökkenti a transzkripció mértékét

29

30 A lac operon pozitív szabályozás alatt is áll: Pozitív a lac operon szabályozása, ha az E. coli egyedüli C- forrása a laktóz (de nem, ha glükóz is van a tápoldatban). A katabolit aktívátor fehérjéhez (catabolite activator protein) (CAP) kötődik a cAMP, aktíválódik, és kapcsolódik a promóter előtti CAP felismerő helyhez (cAMP koncentráció nagyon kicsi glükóz jelenlétében). CAP megváltoztatja a DNS konformációját, megkönnyítve az RNS polimeráz kötődését és a transzkripciót. Ha glükóz és laktóz egyszerre vannak jelen, a glükózt hasznosítja először a kevés cAMP miatt nem aktíválódik elegendő CAP. (diauxiás növekedés) Ha feleslegben adunk cAMP-ot, akkor lesz transzkripció a lac operonról, még glükóz jelenlétében is. 1.A LacI lokális, helyi szabályozó. 2.A CAP globális, máshol is ható szabályozó.

31 A lac operon pozitív szabályozása CAP-val

32 A lac operon szekvencia volt az első jól jellemzett génszabályozási modell : A lac operon promóter -84 bp-ra kezdődik, közvetlenül a lacI stop kodon után és -8 bp-ra végződik a transzkripciós starthelytől. CAP-cAMP kötőhelyek -54 → -58 és -65 → -69. RNS polimeráz kötőhely -47 → -8. Operátor a promóter mellett -3 → +21. mRNS transzkriptum +1 bp-nál kezdődik, az operátorban. A -galaktozidáz génnek a start kodon előtt van egy vezető szekvenciája (riboszóma kötőhely/Shine-Delgarno szekvencia) A -galaktozidáz start kodonodon (AUG) +39 → +41

33 Lac operon szabályozó szekvenciái

34 Az E. coli triptofán operon: Ha van aminosav a tápoldatban, akkor „importálja” az aminosavakat, mielőtt szintetizálna. Az aminosav szintézis gének represszáltak, represszálható operonok. Ha nincs aminosav a táptalajban, a gének „bekapcsolnak” (megnyilvánulnak) és lesz aminosav szintézis. Az E. coli triptofán operonja az egyik legjobban tanulmányozott represszálható operon.

35 Az E. coli Trp operon; (Charles Yanofsky és mtsai.): A Trp operon ~7kb méretű és 5, a triptofán szintézishez szükséges génterméket kódol, trpA-E. A promóter és az operátor a trpE előtt van. A vezető régió (trpL) a trpA-E struktúrgének és az operátor között helyezkedik el. A trpL-ben van egy attenuátor régió (att). TrpR (represszor fehérje gén) a promóter előtt van.

36 Az E. coli Trp operon szerveződése:

37 A trp operon szabályozása: A trp operont két mechanizmus szabályozza: 1.Represszor/operátor kölcsönhatás 2.A megkezdett transzkripció attenuációja (a transzkripció megakad)

38 1. Represszor/operátor kölcsönhatás Ha van triptofán, akkor kötődik a trpR gén termékéhezt. trpR fehérje kapcsolódik a trp operátorhoz és megakadályozza a transzkripciót. A represszió ~70-edére csökkenti a trp operon transzkripciójának mértékét.

39 2. A megkezdett transzkriptum terminációja A transzkripciót attenuáció is szabályozza, egy rövid, nem komplett fehérje transzlálódik. Ha a sejtek „éheznek” triptofánra, akkor a trp gének maximálisan kifejeződnek. Kevésbé súlyos éhezés esetén, csak a maximálisnál kisebb mértékben nyilvánulnak meg. Az attenuáció a transzkripció mértékét 8-10-szeres faktorral szabályozza; a repressziós mechanizmussal kombinálódva szoros mértékben csökkentheti.

40 Az attenuáció molekuláris modellje: A vezető régió (trpL) az operator és a trpE szekvenciák között van. E vezető szekvenciában van az attenuációs régió (att). Az att szekvenciában start kodon, 2 Trp kodon, egy stop kodon, és négy olyan szekvencia régió, amelyek három alternatív másodlagos szerkezet kialakítására képesek. Másoglagos szerkezet Szignál H-híd kötések 1-2 régió szünet H-híd kötések 2-3 régió antitermináció H-híd kötések 3-4 régió termináció

41 A vezető /attenuátor trp operon szekvencia:

42 Emlékezzünk arra, hogy prokariótákban a transzkripció és a transzláció egyszerre, egy helyen. Az mRNS 1 és 2 régiói között kialakuló H-híd kötések (hajtű, stem loop) megakasztja az RNS polimerázt, amint ez a rész szintetizálódott. A szünet éppen elég hosszú ahhoz, hogy a riboszóma kapcsolódjon az mRNS-hez és elkezdje a transzlációt közvetlenül az RNS polimeráz mögött.

43 A riboszóma helyzetének fontos szerepe van az attenuációban: Ha a Trp kevés, vagy nincs utánpótlás (és szükséges): 1.Trp-tRNS-ek nincsenek, a riboszóma megáll a Trp kodonoknál és lefedi az 1-es attenuátor régiót. 2.Az 1-es és 2-es régiók között nem tud kialakulni a hajtű szerkezet, ehelyett a 2-es régió a 3-assal alakít ki hajtűt, amint az elkészült. 3.A 3-as régió (most a 2-essel párban) a 4-essel nem tud kapcsolódni a szintézis után. 4.Az RNS polimeráz folytathatja a 4-es régió után a teljes trp mRNS szintézisét.

44 A riboszóma helyzete fontos az attenuációnál: Ha a Trp elegendő (és nem szükséges): 1.A riboszóma nem áll meg a Trp kodonoknál és folytatja a vezető polipeptid szintézisét, befejezve a 2-es régiónál. 2.A 2-es és a 3-as régiók nem képezhetnek hajtűt, ezért az a 3-as és a 4-es régió között alakul ki. 3.A 3-as és a 4-es régió közötti hajtű az „attenuátor” szekvencia és terminációs szignálként szolgál. 4.A transzkripció azelőtt fejeződik be, hogy a triptofán struktúrgéneket elérte volna az RNS polimeráz.

45 Az attenuációs modell a Trp éheztetett sejtekben.

46 Attenuáció modellje elegendő Trp jelenlétében.

47 Phe, His, Leu, Thr, és Ile operonok feltételezett attenuátorainak aminosav szekvenciái E. coli-ban.

48 E. coli RNS ploimeráz σ kaszkád Gén Mw KDa Alk.-35 Szekv.Szepar.-10 Szekv. rpoA40  subunit --- rpoB155  subnit --- rpoC160  ' subunit --- rpoD70  70 Fő TTGACA16-18 bpTATAAT rpoN54  54 Nitrogén CTGGNA6 bpTTGCA rpoS38  38 Stacioner nem ismert rpoH32  32 hősokk CCCTTGAA13-15 bpCCCGATNT fliA28  28 Flagellum CTAAA15 bpGCCGATAA rpoE24  24 Magas hőm. hősokk nem ismert

49 A Bacillus subtilis életciklusa B. subtilis spórázik, ha a környezeti feltételek kedvezőtlenné válnak ? Osztódási ciklus Spórázás-csírázás ciklus Metabolit és környezeti jelek

50 Szabályozási kölcsönhatások Különböző típusú kölcsönhatások : gének, fehérjék és kis molekulák között a B. subtilis spórázásának szabályozásánál AbrB - AbrB represszálja sin operont SinR~SinI SinI inaktiválja SinR-t Spo0A˜P + Spo0A~P aktiválja sin operont sinR  A  H sinI SinR SinI sin operon

51 Genetikai szabályozó hálózat B. Subtilis-ban A B. subtilis spórázás iniciációjának többé kevésbé teljes genetikai szabályozó hálózata Nagy és komplex

52 A spórázás szimulációja B. subtilis-ban

53 A szimuláció eredményeinek elemzése A spórázás iniciációja a versengő pozitív és negatív szabályozó feedback hurkok eredményeként felhalmozódó Spo0A~P A spo mutánsok nem képesek visszacsatolásokra + phospho- relay Spo0A˜P Spo0A - Spo0E spo0E  A + KinA kinA  H + + sigF  H  F +

54 OPERON REGULON több operon közös szabályozás alatt Pl. σ B regulon


Letölteni ppt "A génaktivitás szabályozása. Nem minden gén nyilvánul meg állandóan Sejt típusa (egérben ~200), sejtciklus állapota Minden sejttípusban ugyanaz a genetikai."

Hasonló előadás


Google Hirdetések