Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Sejtmembrán fehérjék mRNS sejtmag Kromoszómális DNS oligonukleotid citolplazma Cél molekula:fehérjemRNSDNS oligonukleotid iránya a leolvasással megegyezõ.

Hasonló előadás


Az előadások a következő témára: "Sejtmembrán fehérjék mRNS sejtmag Kromoszómális DNS oligonukleotid citolplazma Cél molekula:fehérjemRNSDNS oligonukleotid iránya a leolvasással megegyezõ."— Előadás másolata:

1 sejtmembrán fehérjék mRNS sejtmag Kromoszómális DNS oligonukleotid citolplazma Cél molekula:fehérjemRNSDNS oligonukleotid iránya a leolvasással megegyezõ v. kettõsszálú a leolvasással ellentétes a leolvasással megegyezõ RNS DNS duplex triplex köcsönhatásfehérje-DNSRNS-DNS hibrid/ RNáz H Hoogsteen féle triplex Gátlástranszkripciós szabályozás transzlációtranszkripció Génexpresszió szabályozása szintetikus oligonukleotidokkal

2 Triplex képződésének kölcsönhatásai homopurin homopirimidin szekvenciáknál

3 Antiszensz oligonukleotidok lehetséges célszekvenciái a mRNS-en 1)exon-intron határhoz, slicing gátlás 2)Az 5’ sapka régióhoz 3)Transzlációs iniciációs régióhoz 4)Génen belüli régióhoz Kapcsolódó oligonukleotidok Elsődleges hatásmechanizmus: Az endogén RNázH leemészti a DNS:RNS hibrid RNS szálát

4 2% DCA/DCM di-MeO Tr I 2 / H 2 O N tetrazol Ac 2 O < 1 % > 99 % újabb ciklus hordozó di-MeO Tr O O O O B 2 O O O O P O O hordozó B 1 NC di-MeO Tr O O O O B 2 O O O O P O B 1 NC O O O AcO hordozó B 1 di-MeO Tr O O O O hordozó B 1 O O O OH B 1 di-MeO Tr O O O O NC P O N B 2 Oligonukleotid szintézis:foszforamidit módszer O O O OH hordozó B 1

5 2% DCA/DCM di-MeO Tr I 2 / CS 2 N tetrazol Ac 2 O < 1 % > 99 % újabb ciklus hordozó di-MeO Tr O O O O B 2 O O O O P O S hordozó B 1 NC di-MeO Tr O O O O B 2 O O O O P O B 1 NC O O O AcO hordozó B 1 di-MeO Tr O O O O hordozó B 1 O O O OH B 1 di-MeO Tr O O O O NC P O N B 2 Oligonukleotid szintézis:foszforamidit módszer O O O OH hordozó B 1

6 Oligonukleotid szintézis: H-FOSZFONÁT MÓDSZER Előny: az oxidációt elég a végén elvégezni, vagy – igény szerint – el sem kell  töltés nélküli molekula  Könnyebben átmegy a sejtfalon/membránon H lehet Me is

7 PEPTID NUKLEINSAVAK (PNA) Nincs cukorfoszfát gerinc, ehelyett peptid kötéssel összekapcsolt lánc van Specifikus Stabil PNA T10-LysTTTTTTTTTT-Lys PNA SV40-LysATTTTCTTCATTTTTTCTTC-Lys Ma már külön könyv van a PNA- alkalmazásairól

8 MUTAGENEZIS - in vivo gének elrontására,vagy módosítására Random mutagenezis  találomra létrehozott mutációk  mutagén anyagok: UV, kemikáliák, radioaktív sugárzás  PCR: a hőstabil polimerázok átírási hűsége rosszabb  mutagén törzsek  transzpozon mutagenezis Irányított mutagenezis Adott helyen - deléciók inszerciók léterhozása - pont mutációk létrehozása

9 Ar1Ar2 ori Ar2 Ar1 Ar2 oriV Gének irányított szétroncsolása interpozon mutagenezis poláris hatás vad típus mutáns oriT oriV: szűk gazdaspecificitás Ar: antibiotikum rezisztencia

10 Ar1 ori Ar1 oriV vad típus mutáns poláris hatás ? Deléciós mutagenezis a leolvasási keret sértése nélül oriV: szűk gazdaspecificitás oriT Ar: antibiotikum rezisztencia

11 Gének irányított mutagenezise a dut/ung rendszer alapján Dut: dUTPase Ung: uracil-N-glikoziláz Ne épüljön be dezoxiuracil A DNS-be in vitro szintézis, Klenow pontmutációk!

12 QUICK CHANGE MUTAGENEZIS (STRATAGENE)

13 FEHÉRJE TERMELTETÉS Legyen az prokariótavagyeukarióta természetesvagyszintetikus vad típusúvagymutáns VAN GÉNÜNK:

14 FEHÉRJE TERMELTETŐ RENDSZEREK PROKARIÓTÁK E. coli ismert, Bármilyen fehérje, feltéve, ha - nem túl nagy - nem túl kicsi - nem túl hidrofób - nincs túl sok cisztein benne szekréciós rendszere minimális Bacillus subtilis jól ismert, ha nem is annyira, mint az E. coli van szekréciós rendszere EUKARIÓTÁK élesztő gyorsan szaporodó eukarióta sejtvonal, sok ismeretanyag viszonylag könnyű kezelhetőség poszttranszlációs modifikációk lehetősége emlős sejtvonalak  minden fajta fehérje termeltethető bennük  tranziens expressziós rendszerek viszonylag gyors, de korlátozott lehetôségek,  stabil expressziós rendszerek  hosszú, fáradságos optimalizálást igényel

15 Escherichia coli HÁTRÁNYOK   általában nem szekretál  a sejten belül redukáló atmoszféra diszulfid hidak kialakulása gátolt  az eukariota poszttranszlációs módosítások általában nem megvalósíthatóak  nem alakul ki a megfelelő aktiv szerkezet, rossz folding ELŐNYÖK óriási mennyiségű ismeretanyag könnyű kezelhetőség, gyors növekedési sebesség, viszonylag olcsó médium nagy mennyiségű biomassza gazdaságos előállítása ismert szelekciós rendszerek legtöbb expressziós rendszer

16 STRATÉGIÁK TÚLTERMELTETÉSRE  a fehérje a teljes növekedési fázis alatt expresszálódik  nagy sejttömeg elérése után a fehérje visszanyerése  nem igazán használatos, toxicitási problémák miatt KONSTITUTÍV PROMÓTER  a promoter represszált állapotban van a növekedés egy bizonyos fázisáig  valamilyen indukcióval derepresszió  további növesztés  fehérje visszanyerése  legáltalánosabban használt stratégia  toxicitás sok esetben megoldható INDUKÁLT TERMELTETÉS

17 PROKARIÓTA EXPRESSZIÓS VEKTOR ELEMEI TT SZF SDkódoló szekvencia Pr TSZE TTGACAN 17 TATAAT 5’ UAAGGAGGN (3-11) START kodon AUG GUG UUG STOP kodon UAAU UGA UAG ARORI  GS Pr: promóter TT: transzkripciós terminációs szignál, SZF: szabályozó fehérje,, TSZE: transzlációt szabályozó elemek, SD: Shine-Dalgarno szekvencia, AR: antibiotikum rezisztencia, ORI: replikációs origo GS: gazdasejt

18 FEHÉRJERNS transzláció transzkripció DNS transzripciós szinten poszt-transzkcripciós szinten (mRNS degradáció, protein stabilitás, stb.) A génexpresszió szabályozása

19 Különböző faktorok relatív hatása a fehérje termeltetésre E. coli-ban  Promóter indukálhatóságkb x  Gazdasejt kb x  A mRNS 5’ struktúrájakb. 100 x  Transzlációkb. 100 x  növekedési sebességkb. 50 x (mRNS stabilitás)

20 túltermeltetésnél: ne legyen nagyon magas a kópiaszám  toxikus fehérjék alapexpressziójának visszaszorítása “Runaway” plazmidok: indukálható kópiaszámú plazmidok

21

22 TRANSZKRIPCIÓ  Iniciáció fehérje termeltetés során a legfontosabb  Elongáció mivel a gén belsejében van, nem manipulálható  Termináció a transzkripció befejezése, a transzkripciós apparátus túlterhelésének elkerülésére

23 A transzkripció iniciációja prokariótákban 5’ 3’ promóter 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ sigma faktor RNS polimeráz holoenzim k1k1 k -1 k2k2 k -2 5’ 3’ Ha k 1 >> k -1, akkor a polimeráz holoenzim nagyon erősen kötődik a promóter szekvenciához, a polimeráz nehezen tudja elindítani a polimerizációs reakciót. Tehát a transzkript mennyisége csökken, habár in vitro a promóter és a holoenzim közötti kapcsolat erős. ?? /`/`  NTD  CTD RNS polimeráz alegységek: ,  `, , , 

24  70 promoter szekvencia: -10 and -35 régiók

25 A tökéletes  70 -függő promóter AAATAAAATTTTTAAn..nTTGACAnnn…nnnTGnTATAATnnattA +1-10Ext.-35UP elem Az  alegység kötődik A  70 ismeri fel 4-6nt 14nt 17nt 4-6nt 

26 Bakteriális  faktorok

27 Különböző gének expresszióját különböző szigma faktorok befolyásolják gén expresszió változás  Morfológiai & fiziológiás változások  Adaptáció / Védekezés tápelvonás, Stressz, Vasra éheztetés, sejtsűrűség, Felületi adházió Transzkripciós faktorok (Szigma)

28 Két  faktor felépítése

29 A génexpresszió tanulmányozása különböző módszerekkel különböző szinteken fehérje érése transzláció transzkripció Enzim aktivitás mérés mRNS detektálása Riportergén riporter fehérje aktivitás  promóter aktivitás Western blot fehérje detektálása A vizsgált operon promóter

30 ELECTRO MOBILITY SHIFT ASSAY (EMSA) I.  más néven gél retardációs assay  a DNS-t, amely feltételezhetően fehérjét köt, megjelöljük  jelölés lehet végen, szálon belül, egyszálon, kétszálon, kötési kísérletben a DNS kétszálú!  a DNS ne legyen től hosszú bp, minél hosszabb a DNS, annál több nem specifikus reackió történik  lehet tiszta fehérje vagy fehérje populáció DNS jelölés DNS kötő fehérje összekeverés nem kötődikkötődik Natív poliakrilamid gél -: fehérje nélkül, +: fehérjével összekeverve nem kötődik - + kötődik - + nem specifikusan kötődik - +

31 ELECTRO MOBILITY SHIFT ASSAY (EMSA) II.  a mobilitás eltolódás inkább a komplex méretét jellemzi, a kölcsönhatás errősségét nem  a kölcsönhatás erősségét a nem kötöt DNS, és a kötésben levő DNS jelének intenzitása jellemzi minél kevesebb fehérje okoz erős jelet az eltolódott sávban annál erősebb a kölcsönhatás titrálás fehérje mennyiségre hozzáadott fehérje mennyiség nő  SUPERSHIFT ASSAY - ha van tippünk, hogy milyen fehérje kötődik - és van rá specifikus ellenanyagunk nem kötődikkötődikellenanyag is kötődik : fehérje nélkül, +: csak fehérje hozzáadása, ++: fehérje és ellenanyag hozzáadása a DNS - fehérje kölcsönhatás erősségéről ad felvilágosítást, nem a képződött mRNS mennyiségéről

32 DNázI FOOT PRINT I. DNS hossz 100 – 200 bp DNS jelölés szigorúan a végén, szálspecifikusan mind a két jelölt szállal meg kell csinálni a kötési kísérletben a DNS kétszálú DNázI G A+G C+T C D denaturáló poliakrilamid gélelektroforézis Maxam-Gilbert létra DNázI hasítás * **************** ** ** **************** ** **

33 DNázI FOOT PRINT II. DNázI G A+G C+T C D- D+ Maxam-Gilbert létra DNázI hasítás -: fehérje nélkül +: fehérje jelenlétében hiperszenzitív hely (HSH) HSH ****** ** ******** ****** **********

34 DMS G A+G C+T C G denaturáló poliakrilamid gélelektroforézis Maxam-Gilbert létra piperidin hasítás Me G-nél ******** ******** Me piperidin METILÁCIÓS INTERFERENCIA DNS jelölés szigorúan a végén, szálspecifikusan a DNS-t Maxam-Gilbert szerint dimetilszulfáttal (DMS) metiláljuk mind a két jelölt szállal meg kell csinálni a kötési kísérletben a DNS kétszálú G G G G G G G G csak a jelölt szálon szemléltetve

35 modell: DMS EMSA - +    kivágás, izolálás piperidin hasítás denaturáló PAGE G A+G C+T C PM K NK Maxam-Gilbert létra piperidin hasítás Me G-nél ********* * * PM: protein mentes K: kötött NK: nem kötött PM és NK mintázat K mintázat METILÁCIÓS INTERFERENCIA II. tegyük fel, hogy ezek a G-k esszenciálisak a kötéshez

36 UV KERESZTKÖTÉS (CROSS LINKING) Ismeretlen DNS kötő fehérjék molekulatömegének becslésére 1. A DNS szálat szálon belül jelöljük, és Br-dUMP-t építünk be (a Br-dUMP nem zavarja a kötődést) : Br MS? EMSA UV fény  kivágás, izolálás   DNázI kezelés a fehérje DNS komplex kötés kovalens lesz jelölt fehérje SDS-PAGE minta marker

37 - Northern-blot és hibridizáció - reverz-transzkripció kapcsolt kvantitatív PCR - korrekt, de belső összehasonlító standardokat igényel A mRNS mennyiségének meghatározása

38 In vitro transzkripció Regulátor G mentes kazetta régió (3-400 bp) transzkripcionálisan aktív sejt vagy sejtmagi extraktum + ATP, CTP,  32 P-UTP, a képződött radioaktív RNS analizise denaturáló PAGE-n. csak a fenti bp-os fragmentum fog látszani, a többi tartalmaz G-t  ezek transzkirpciója leáll mennyiségi becslés: denzitometriásan, vagy PhosphorImager-rel Promóter elsősorban transz szabályozó elemek hatásának vizsgálatára alkalmas

39 Regulátor régió riporter gén (pl. lacZ) Promóter Riporter gének alkalmazása  -galaktozidáz (LacZ) SEJT  -galaktozidáz aktivitás mérés feltételezi, hogy nincs poszt-transzkripciós szabályozás, és az enzim specifikus aktivitása is minden mintára egyforma aktivitás mérés kiküszöbölése GFP: Green Fluorescent Protein, gerjesztve floureszkál a kapott aktivitást illetve szignált normálni kell a sejt vagy protein mennyiségére


Letölteni ppt "Sejtmembrán fehérjék mRNS sejtmag Kromoszómális DNS oligonukleotid citolplazma Cél molekula:fehérjemRNSDNS oligonukleotid iránya a leolvasással megegyezõ."

Hasonló előadás


Google Hirdetések