Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

DNS replikáció Szükséges funkciók –Iniciáció Kell egy origóhoz kötődő fehérje (DnaA E. coli) Majd összeáll a helikáz komplex az origónál –Baktériumoknak.

Hasonló előadás


Az előadások a következő témára: "DNS replikáció Szükséges funkciók –Iniciáció Kell egy origóhoz kötődő fehérje (DnaA E. coli) Majd összeáll a helikáz komplex az origónál –Baktériumoknak."— Előadás másolata:

1 DNS replikáció Szükséges funkciók –Iniciáció Kell egy origóhoz kötődő fehérje (DnaA E. coli) Majd összeáll a helikáz komplex az origónál –Baktériumoknak egy origó –Néhány Archea két origójú, de hogy mindkettőt egyszerre használják-e? –A hélix szálainak szétválasztása DNS helikáz Topoizomeráz, hogy megszüntesse az extra szupercsavarokat Topoizomeráz, hogy elkészítse az új DNS-en a szupercsavarokat

2 Replikáció, folyt. –Az egyszálú DNS-t stabilizálja az SSB (SSB= single strand binding protein) –A régi információ másolása új szálra Primer a DNS polimeráznak Primer eltávolítása

3 A replikációs villa A szintézis mindig  irányba A topoizomeráz nincs feltüntetve

4 Primer eltávolítása Alapvetően egy javító művelet A DNS polimeráz I végzi –3  5  exonukleáz aktivitás –5  3 polimeráz aktivitás

5 Az Okazaki fragmentumok sorsa Okazaki f ragment umok 1.1. DN S RN S Az előző fragmentum nő Végül minden fragmentum tisztán DNS Nick-eket a DNS ligáz zárja Pol I a fragmentumok közötti nick-hez kapcsolódik Nick -ek maradnak Primer rövidül

6 A replikáció iniciációja Specifikus helyen kezdődik oriC –Primer szintézis kell –oriC védett a véletlen transzkripciótól –E. coli-ban az iniciációhoz szükséges a DnaA fehérje és a transzkripció iniciációja a közeli mioC promóterről

7 oriC : konzervált szerkezet E. coli B. subtilis M. luteus Ps. putida

8 A replikációs üzem Bacillus subtilis Az oriC vándorlása biztosítja a kromoszóma DNS-ek szegregációját

9 Replikáció terminációja A folyamat túlmegy a végponton Átfedő fragmentumok képződnek A gyűrűs molekulát rekombináció állítja helyre E. coli

10 Lehetséges terminációs hibák

11 Restrikció és modifikáció Restrikciós enzimek típusai –I. Egy fehérje, restrikció és modifikáció is (EcoK) Ha a DNS egyáltalán nem metilezett, a kötőhelytől néhyány kb-ra vág Ha a DNS hemimetilált, akkor módosítja azt –II. két fehérje molekula A restrikciós enzim a felismerő helynél/ben vág Módosított vagy módosítatlan DNS-t is vághatja ( az enzimre jellemző specifikussággal) Génsebészetben használatosak

12 Restrikció, folyt. –III. A restrikciós enzim a felismerő hely egyik oldalán meghatározott távolságra vág Izoschizomerek azok az enzimek, amelye különböző mikroorganizmusokból származnak és ugyanaz a felismerő helyük

13 RM, folyt A restrikciós enzimeken alapul a génsebészetRestriction enzymes are basis of genetic engineering Felismerő hely Átellenes vágás Minden fragmentum vágott végei azonosak AC TG Minden fragmentum, bárhonnan származik is a DNS Bármelyik másik fragmentumhoz illeszkedik

14 Elektroforézis Általában agaróz (PAGE) –Különlegesen tiszta agar-agar –DNS festése fluoreszkáló festékkel (EBr) Mi a fluoreszcencia? Egy hullámhosszúságú fotonok abszorbciója és más hullámhosszú fotonok emissziója Ebben az esetben besugárzás közeli UV-val és vörös fénnyel világít

15 Agaróz gél DNS minta felvitel itt Vándorlás Negatív elktróda itt Pozitív elektróda itt Kis fragmen- tumok ezen a végen

16 Southern Blot Kérdés: Hogyan tudjuk megmondani, hogy melyik fragmentumban van az általunk keresett szekvencia? –Fragmentumok vizsgálata –A keresett DNS szekvenciánkkal komplementer, jelölt próba RNS, vagy DNS kell –DNS átszivatása (blot) a gélből szilárd hordozóra (membrán) –DNS denaturálása –Egyszálúsított jelölt próba lötyögtetése a hordozó fölött. Mosás.

17 Southern Blot, folyt. A megkötött próba kimutatása –Kereső, próba DNS-t jelölhetjük izotóppal autoradiográfia –Próbát jelölhetjük biotinnal A biotin nagyon erősen kötődik avidinhez, vagy streptavidinhez Avidint egy enzimhez kötjük. Az enzim reagál a szubsztráttal és színes terméket kapunk. Ha DNS-t mutatunk ki, akkor Sothern blot, ha RNS-t, akkor Northern blot

18 Southern Blot Nem emésztődött DNS Csak néhány sáv mutat radioaktivitást

19 DNS szekvenálás A legnépszerűbb Fred Sanger, a DNS replikáción alapuló módszere –A DNS replikáció onnan indul, ahol primert talál –Addig megy, míg terminátort nem talál, vagy lineáris DNS-nél a molekula végéig, vagy ha hiányzik a 3’-hidroxil csoport dNTP mix+kis mennyiségű specifikus ddNTP Amikor a ddNTP beépül a szintézis befejeződik A fragmentum első bázisa a primeré, utolsó bázisa a ddNTP

20 Didezoxi bázis (ddNTP) 5 szén 3 szén 5 szén Nincs OH csoport

21 Szekvencia analízis A fragmentumok elválasztása méret szerint –Elektroforézis –Akrilamid gél Ma már automatizált a szekvencia analízis, kézi szekvenálás speciális esetekben

22

23 Polimeráz láncreakció (PCR) Polymerase Chain Reaction A DNS egy régiójának amplifikálására alkalmas módszer Templát DNS+primerek+dNTPmix+DNS polimeráz 3 3 A primerek meghatározzák az amplifikálandó régiót Templát DNS denaturálása hővel primerek Alacsonyabb hőmérsékleten a primerek megtalálják a helyüket

24 PCR, folyt. Replikácó túlhalad a másik primer kötőhelyén Visszahűtés, primerek újra kötődnek Újra denaturáljuk a DNS-t melegítéssel  3 3 Új DNS szintézise túl a másik primer helyen, vagy a molekula végéig Minden ciklusban a specifikus fragmentum megduplázódik.

25 PCR, folyt. A normális polimeráz magas hőmérsékleten inaktíválódik Extremofileknek hőstabil DNS polimeráza van. –Termofil mikroorganizmusok –Thermus aquaticus –A restrikciós enzimek analógiájára: Taq polimeráz –És még sok másik.


Letölteni ppt "DNS replikáció Szükséges funkciók –Iniciáció Kell egy origóhoz kötődő fehérje (DnaA E. coli) Majd összeáll a helikáz komplex az origónál –Baktériumoknak."

Hasonló előadás


Google Hirdetések