Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

1 Fonalas fágok I. M13, f1 és fd fágok, genomjuk 98%-ban azonos  rekombinálnak egymással Az érett fágok genomja egyszálú cirkuláris DNS, a sejten belül:

Hasonló előadás


Az előadások a következő témára: "1 Fonalas fágok I. M13, f1 és fd fágok, genomjuk 98%-ban azonos  rekombinálnak egymással Az érett fágok genomja egyszálú cirkuláris DNS, a sejten belül:"— Előadás másolata:

1 1 Fonalas fágok I. M13, f1 és fd fágok, genomjuk 98%-ban azonos  rekombinálnak egymással Az érett fágok genomja egyszálú cirkuláris DNS, a sejten belül: RF, replikatív forma  ez alkalmas genetikai manipulációkra A fág genomjának 90%-a 10 fehérjét kódol, nagyobb intergenikus régió a VIII és a III gének illetve II és IV gének között, regulátor funkció A fág a szexpiluson keresztül fertőz, a DNS (+) szál jut be a sejtbe  ebből lesz kétszálú replikatív forma perc, kópia Nem öli meg a gazdasejtet, csak lassítja a növekedést VIII fehérje a fő strukúr protein, 2700 kópia, a III. számú fehérje a filament végén néhány kópiában Az RF forma képződése után transzkripció, transzláció, Replikáció: II fehérje töréspontot idéz elő, DNS polimeráz I polimerizál WC papír modell. a II. fehérje vagdossa egységnyi darabokra V. fehérje: egyszálú DNS kötő fehérje, represszálja a II gén expresszióját  kópiaszám kontroll

2 2

3 3 A fonalas fágok életciklusa

4 4 Fonalas fágok II. A fág nem a sejten belül szerelődik össze, hanem a genom az V. fehérje a (+) szálhoz kapcsolódva vándorol a membránhoz, ott a DNS a membránon keresztüljutva beburkolódik a kapszid fehérjékbe Nincs szoros mérethatára a pakolódásnak Fonalas fágvektorok 500 bp a II és IV gének között nem kidobható: a (+) és (-) szál szintézisének iniciációját és terminációját befolyásolják,  független transzkripciós terminációs szignál inszerciók befolyásolják a fág replikációt, mutációk a II és IV génben kompenzálnak LacZ  komplementáció, nincs antibiotikum minireplikon kiugrása

5 5 Egy fonalas fág térképe

6 6

7 7 Epitóp könyvtár készítése, fág display vektorok gVIII (vagy gIII) gén (NNN) x X : 6 vagy hosszabb

8 8 Egy példa: anthrax toxin inhibitor tervezése phage display technikával Az anthrax toxin érése, patogenezise, potenciális célpontok A (PA 63 ) heptamert felkötjük egy oszlopra

9 9 Egy példa: anthrax toxin inhibitor tervezése phage display technikával II. átfolyó specifikus felkötődik elúció DNS izolálás, szekvenálás (NNN) x A (PA 63 ) 7 oszlopon kromatografáljuk ACCTATTGGTGGCTGGAT TYWWLD

10 10 Másik példa: monoklonális ellenanyagok előállítása pIII fág display technikával Egy demonstrációs anyag a pIII alapú fág display technikára:

11 11 Fagemidek: fonalas fágok és plazmidok hibridjei

12 12 A fágok általános felépítése  genetikai anyag: kb duplaszálú lineáris DNS  fertőzéssel jut a sejtbe,  nagy hatékonyság  két életciklus: - lizogén: a fág genetikai anyaga beépül a kromoszómába, a sejt túlél - lítikus: érett fág képződése során a sejtek lizálnak elpusztulnak  a végeken ragadós. ún. ’cos’ végek bal kar 20 kb centrális régió 14 kb jobb kar 9 kb cos a középső, centrális régió eltávolítható EcoRI BamHI SalI EcoRI BamHI SalI cos

13 13

14 14 A lambda fág életciklusa

15 15

16 16 Lambda fág példák Helyettesítő/ replacement vektorok Inszerciós vektorok

17 17 A pakolódás feltétele, hogy a rekombináns gemon mérete a vad típus méretének 79 – 105 %- a lehet. A klónozás menete helyettesítő vektorok esetén

18 18 Szelekciós elvek fágok esetén bepakolódási szabály: vad típusú fág méretének %

19 19

20 20 Génátvitel transzdukcióval baktériumokban fág DNS bakteriális DNS-t is tartalmazó többnyire defektív fágok intakt normál fágtranszdukáló fág bakteriális fágfertőzés lizogén életciklus fág genom integrálódása a baktérium kromoszómájába a fág által hordozott bakteriális DNS beépülése rekombinációval

21 21 Kozmidok: plazmidok és fágok hibridjei fertőzéssel bejuttatható plazmidok

22 22

23 23 Mesterséges kromoszómák: BAC (bacterial artificial chromosome) vektorok

24 24 Mesterséges kromoszómák: YAC (yeast artificial chromosome) vektorok

25 25 GÉNEK ELŐÁLLÍTÁSÁNAK STRATÉGIÁI Gének izolálása A megfelelő organizmus génkészletéből a kívánt régiót tartalmazó szakasz valamilyen módon való kinyerése elterjedtebb, -általában gyorsabb, kevesebb munkát igényel (ha lehetséges) - nem feltétlenül szükséges szekvencia információ, de nem árt, ha van - a különböző organizmusok genom szekvenciái nagy segítséget jelenthetnek - hátrány: kodon preferencia adott, nem tervezhető Gének szintézise Szintetikus oligonukleotidokból történő összeépítés - kevésbé elterjedt - a gén hosszától függően sok munkát igényelhet, - a fehérje elsődleges szekvenciáját ismerni kell - előny: tervezhető a biológia szabályainak figyelembevételével, - az optimális kodon felhasználás a gazda sejthez igazítható, az optimális fehérje túltermeltetési tapasztalatok jobban kamatoztathatók

26 26 KÖNYVTÁRAK TÍPUSAI - genomiális a teljes genomból készül, elvileg minden információt tartalmaz (pl. nem transzlálódó régió, szabályozó régiók, intronok) mind prokariótákból, mind eukariótákból - cDNS az aktívan termelődő mRNS-ekből készül csak az érett mRNS szekvenciáját tartalmazza (nincs intron szabályozó régió stb) csak eukariótákból expressziós a cDNS-eket ún. expressziós kazettába klónozzuk, ezáltal a kódolt fehérje (ha a mRNS kódol ilyet) aktívan termelődhet Követelmények a könyvtárakkal szemben - fedje le a teljes genomot, illetve mRNS populációt - ne legyen redundáns

27 27 konkatamer in vitro pakolás: összekeverés fágfehérje extraktummal GENOMIÁLIS KÖNYVTÁR KÉSZÍTÉSÉNEK SÉMÁJA bal kar jobb kar bal karjobb kar centrális régió hasító helyek emésztés részleges vagy kb méretű teljes emésztés fragmentek ligálás A pakolódás feltétele, hogy a rekombináns gemon mérete a vad típus méretének 79 – 105 %- a lehet.

28 28 Genomiális könyvtár készítése kozmidban  Genomi DNS részleges emésztése Sau3A-val (a Sau3A kompatibilis véget ad a BamHI-gyel  A 30 – 45 kb régió méret szerinti elválasztása BamHI- SmaI emésztés SmaI c2RB 6.8 kb cos EcoRI BamHI HindIII ClaI Amp r ori Km r Amp r ori cos ligálás 30 – 45 kb-os fragmentek cos in vitro pakolás fehérje extraktummal, fertőzés szelekció ampicillin rezisztens klónokra kozmid könyvtár

29 29 PARCIÁLIS GENOMI KÖNYVTÁR KÉSZÍTÉSE csak akkor, ha van hibridizációs próbánk Előzetes Southern M A B A+BM C D C+D Preparatív gél elektroforézis A + B izolálás, Southern M vektor A B hasítás A+B-vel defoszforilálás AB 2. frakció ligálás részleges könyvtár

30 30 Southern blot és hibridizáció

31 31 Bakteriális shot-gun könyvtár készítése kromoszómális DNS nebulizátor összetört DNS végek tompítása Preparatív gél elektroforézis 2-3,5 kb fragmentek defoszforilálás transzformáláselektroporálás E. coli

32 32 A KROMOSZÓMÁLIS SÉTA Ismert marker 1. Cél Ismert marker klón 2. klón 3. klón 4. klón :EcoRI :BamHI :HindIII :PstI :SmaI

33 33 A KROMOSZÓMÁLIS SÉTA II

34 34 cDNS könyvtár A mRNS-ekkel szemben támasztott követelmények  Integritás  A mRNS mérete, degradált-e Megoldás: denaturáló gélelektroforézis (várt méret kb, a többség kb)  Lehet-e teljes hosszúságú cDNS-t szintetizáltatni Megoldás: elõzetes reverz transzkripció jelölt nukloetidokkal elektroforézis  Lehet-e nagy molekulasúlyú fehérjéket in vitro szintetizálni Megoldás: in vitro transzláció jelölt aminosavakkal  A kérdéseses fehérjét tudjuk-e szintetizáltatni Megoldás: in vitro transzláció + immunoprecipitáció

35 35  A kérdéses mRNS előfordulási gyakorisága különböző mRNS emlős sejtekben  nagy gyakoriságú %, pl. globin nem problematikus  kis gyakoriságú  0.5 % nagy könyvtárat kell készíteni, és a detektálás is gond N = ln(1-P) / ln(1-1/n) N: a szükséges klónok száma a könyvtárban, P: annak a valószínûsége, hogy a keresett klón benne legyen a könyvtárban, 1/n: az a mRNS frakció, ami 1 db keresett mRNS-t tartalmaz immunoprecipitált in vitro transzlált termék/ összes transzlált termék pl. 14 molekula/sejt,  1/n = 37000, P= 0.99, N= A cDNS könyvtár mérete

36 36 Megoldás: dúsítás (  1% alatt célszerű) mRNS méret szerinti elválasztása - elektroforetikus úton - sucrose grádiensen minden frakciót tesztelni kell immunoprecipitációval cDNS méret szerinti elválasztása könnyebb, ponotsabb Poliszómák immunoprecipitációja technikailag nehéz, és csak megbízható források esetén működik Dúsítási eljárások

37 37 cDNS-könyvtár készítése primer adapter módszerrel

38 38 cDNS-könyvtár készítése

39 39 cDNS könyvtár készítése: Okayama-Berg módszer I

40 40 cDNS könyvtár készítése: Okayama-Berg módszer II

41 41

42 42 Biotinilálás

43 43 Szubsztraktív hibridizáció AAAAAAAAA 3' 5' TTTTTTTTT biotin reverz transzkripció B B B RnázH immobilizált streptavidin SA B B B cDNS könyvtár csak indukált mRNS átfolyó cDNS, jelölés hibridizáció nem indukált minta, mRNS tisztításindukált minta, mRNS tisztítás


Letölteni ppt "1 Fonalas fágok I. M13, f1 és fd fágok, genomjuk 98%-ban azonos  rekombinálnak egymással Az érett fágok genomja egyszálú cirkuláris DNS, a sejten belül:"

Hasonló előadás


Google Hirdetések