Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

1 A NUKLEINSAVAK MANIPULÁCIÓJA SORÁN HASZNÁLATOS ENZIMEK RESTRIKCIÓS ENDONUKLEÁZOK Három fő csoport 1970 – A molekuláris biológia forradalmának kezdete.

Hasonló előadás


Az előadások a következő témára: "1 A NUKLEINSAVAK MANIPULÁCIÓJA SORÁN HASZNÁLATOS ENZIMEK RESTRIKCIÓS ENDONUKLEÁZOK Három fő csoport 1970 – A molekuláris biológia forradalmának kezdete."— Előadás másolata:

1 1 A NUKLEINSAVAK MANIPULÁCIÓJA SORÁN HASZNÁLATOS ENZIMEK RESTRIKCIÓS ENDONUKLEÁZOK Három fő csoport 1970 – A molekuláris biológia forradalmának kezdete A Haemophilus influenzae restrikciós endunuklázának felfedezése I típus Specifikus szekvenicákat ismer fel, de elvándorol a DNS-en (~ bázis) mielőtt az egyik szálat elhasítja, nukleotideokat szabadít fel (~75) a hasítás helyén. Egy másik endonuckleáz kell a második szál hasításához Pl. EcoK. Mg2+, ATP és SAM (S-adenosyl methionine) SAM kell hozzá

2 2 A NUKLEINSAVAK MANIPULÁCIÓJA SORÁN HASZNÁLATOS ENZIMEK RESTRIKCIÓS ENDONUKLEÁZOK II típus Speciális célszekvenciát ismer fel és hasítja a DNS-t mindkét szálon a felismerési szekvenciában vagy annak környezetében pl. EcoRI Mg2+ kell Ez a típus az elterjedt III. típus I és II. Kombinációja. Mindkét DNS szálat hasítja egy meghatározott távolságra a felismerési szekvenciától plHgaI Mg2+-t ésATP-t igényel

3 3 A NUKLEINSAVAK MANIPULÁCIÓJA SORÁN HASZNÁLATOS ENZIMEK RESTRIKCIÓS ENDONUKLEÁZOK EnzimFelismerőhely hossza Felismerő-hasítóhely Forrás organizmus AluI4 AG/CTArthrobacter luteus HphI5 GGTGAN 8 /Haemophilus parahaemolyticus EcoRI6 G/AATTCEscherichia coli BamHI6 G/GATCCBacillus amyloliquefaciens Ragadós végeket adó hasítások (sticky end) 5' túlnyúló SalI6Streptomyces albis 3' túlnyúló KpnI6Klebsiela pneumonia Tompa végű hasítások (blunt end) HaeIII4Haemophilus aegyptus 5' G TCGAC 3' 3' CAGCT G 3' 5' GGTAC C 3' 3' C CATGG 5' 5' GG CC 3' 3' CC GG 5'

4 4 Palindrom példák KIS EREK MENTÉN LÁP SÍK ÖLÉN ODA VAN A BÁNYA RABJA JAJ BARANYÁBAN A VADON ÉLŐ KIS PÁLNÉT NEM KERESIK

5 5 Isoschisomers AtcI6 5' GGTAC/C 3' KpnI 5' GGTAC/C 3' XmaI6 5' C/CCGGG 3' SmaI 5' CCC/GGG 3' Kompatibilis véget adó enzimek SalI6 5' G/TCGAC 3' XhoI 5' C/TCGAG 3' FEHÉRJE TÚLTERMELTETÉS SZEMPONTJÁBÓL KITÜNTETT ENZIMEK AflIII6 5' A/CPuPyGT 3' BspHI6 5' T/CATGA 3' NcoI6 5' C/CATGG 3' NdeI6 5' CA/TATG 3'

6 6 DNS METILÁZOK - dam metiláz (dezoxiadenin metiláz) 5’ GATC 3’ felismerő hely N 6 pozícióban metilez adenin sok dam metiláz érzékeny enzim van pl. MboI, XhoI, egyenként ellenőrizni kell, érzékenység esetén - dam - törzs használata - nem érzékeny izoskizomer használata (ha van) (MboI - Sau3AI)

7 7 -dcm metiláz (dezoxicitozin metiláz) 5’ CCAGG 3’ vagy 5’ CCTGG 3’, C 5 pozícióban metilez citozin - hasonlóképpen léteznek dcm metiláz érzékeny enzimek - megoldás ugyanaz, mint a dam esetén Sok metiláz van még, hasonló felismerő kanonikus szekvenciával, mint a restrikciós enzimek pl. M. EcoRI metiláz

8 8 METILÁCIÓ FÜGGŐ RESTRIKCIÓS RENDSZEREK - mrr 6 metiladenin esetén - mcrA m5 CG szekvencia kell - mcrB Pu m5 C esetén METILÁZOK FELHASZNÁLÁSI TERÜLETE: -DNS védelem hasítások ellen - laza specificitású helyek specificitás növelése (ha az egyik szekvencia tartalmazza a metiláz felismerő szekvenciáját (pl. HincII: GTPyPuAC, amiből GTCGAC a TaqI metiláz felismerőhelye, HincII metiláz érzékeny - metiláció függő restrikciós helyek előállítása

9 9 Polimerázok - DNS függő DNS polimerázok - RNS függő DNS polimerázok - Templátfüggetlen DNS polimeráz - DNS függő RNS polimeráz 5’  3’ polimeráz aktivitás

10 10 DNS függő DNS polimerázok

11 11

12 12 DNS jelölés, nick transzláció

13 13

14 14

15 15

16 16 denaturálás N: A,C,G,T (NNNNNN) hibridizáció DNS polimeráz dNTP polimerizáció denaturálás Jelölt szálak DNS jelölés, random priming

17 17

18 18

19 19 DNS függő termofil DNS polimerázok

20 20 Templát független DNS polimeráz

21 21 RNS függő DNS polimeráz

22 22

23 23 DNS függő RNS polimerázok

24 24

25 25

26 26

27 27

28 28

29 29

30 30

31 31

32 32

33 33


Letölteni ppt "1 A NUKLEINSAVAK MANIPULÁCIÓJA SORÁN HASZNÁLATOS ENZIMEK RESTRIKCIÓS ENDONUKLEÁZOK Három fő csoport 1970 – A molekuláris biológia forradalmának kezdete."

Hasonló előadás


Google Hirdetések