Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Antibiotikumok fejlesztése a genomika segítségével Készítette: Terecskei Kata IV.biológus.

Hasonló előadás


Az előadások a következő témára: "Antibiotikumok fejlesztése a genomika segítségével Készítette: Terecskei Kata IV.biológus."— Előadás másolata:

1 Antibiotikumok fejlesztése a genomika segítségével Készítette: Terecskei Kata IV.biológus

2 Bevezetés: as évek: antibiotikumok ‘aranykora’ 1970-es évek: megnyertnek hitt csata 1985 óta: antibiotikum rezisztencia Methicillin-rezisztens Staphylococcus Methicillin-rezisztens Staphylococcus aureus (MRSA) aureus (MRSA) Vancomycin-rezisztens Enterococcusok (VRA) Vancomycin-rezisztens Enterococcusok (VRA) Streptococcus pneumoniae Streptococcus pneumoniae Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis Multidrog rezisztens Mycobacterium tubercolosis Multidrog rezisztens Mycobacterium tubercolosis Pseudomonasok Pseudomonasok

3 1990-es évekig gyógyszeripar célja: meglevő szerek fejlesztése (pl: tetraciklinek  glicilciklinek kinolok  fluorokinolok) Genomika: új molekuláris targetek Escherichia coli, Bacillus subtilis modellek helyett direkt a patogénnel való munka. Gram-negatív baktériumok antibiotikum rezisztenciája Magyarországon

4 Genom szekvenálás: új target azonosításának alapja Szekvenálás automatizálása Szekvenálás automatizálása Első publikált megszekvenált teljes bakteriális genom: Haemophilus influenzae (1995) Első publikált megszekvenált teljes bakteriális genom: Haemophilus influenzae (1995) Mai antibiotikumok célpontja: DNS, RNS, fehérje, sejtfal- szintézis  bővülhet a hatáskör Mai antibiotikumok célpontja: DNS, RNS, fehérje, sejtfal- szintézis  bővülhet a hatáskör Klasszikus módszer: cidikus vagy sztatikus vegyület keresése Ésszerűbb target-alapú stratégia Klasszikus módszer: cidikus vagy sztatikus vegyület keresése Ésszerűbb target-alapú stratégia Genomika: szekvenálás + bioinformatikai analízis Genomika: szekvenálás + bioinformatikai analízis

5 Target szelektálás Kritériumok: - emberben ne forduljon elő - emberben ne forduljon elő - esszenciális legyen a baktérium növekedéséhez vagy életképességéhez - esszenciális legyen a baktérium növekedéséhez vagy életképességéhez - expresszálódjon a fertőzés folyamán és fontos legyen abban - expresszálódjon a fertőzés folyamán és fontos legyen abban Target spektrum és szelektivitás: ORF azonosítás ORF azonosítás In silico vizsgálatok In silico vizsgálatok Filogenetikai vizsgálatok (különböző fajokban, egy faj különböző izolátumaiban) Filogenetikai vizsgálatok (különböző fajokban, egy faj különböző izolátumaiban) In silico vizsgálat fontossága: UDP-N-acetil-glükóz-amin enolpyruvát transzferáz (MurA)

6 Esszenciális génről van-e szó? Gén-inaktiválás: - plazmid-beépítés - transzpozon-inszerciós mutagenezis - transzpozon-inszerciós mutagenezis - allél-replacement mutagenezis - allél-replacement mutagenezis - in vitro kondícionálisan letális mutánsok izolálása (géntermék szintjének vagy aktivitásának csökkentése) - in vitro kondícionálisan letális mutánsok izolálása (géntermék szintjének vagy aktivitásának csökkentése) Problémák: - kapcsolat kimutatása a target gátlása és az antimikrobiális hatás között - nonspecifikus hatások - nonspecifikus hatások - nem várt toxicitás - nem várt toxicitás met-tRNS szintetáz polipeptid deformiláz

7 Transzkripció a fertőzés során IVET (in vivo expression technology) IVET (in vivo expression technology) DFI (differential fluorescent induction) DFI (differential fluorescent induction) STM (signature tagged mutagenesis) STM (signature tagged mutagenesis) microarray technika microarray technika RT-PCR alapú technika RT-PCR alapú technika

8 Ígéretes targetek Amino-acil tRNS szintetázok: Amino-acil tRNS szintetázok: 20 van a prokarióta sejtben  20 új target? Mupirocin - isoleucyl tRNS szintetázt gátolja  Bactroban TM Polipeptid deformilázok: Polipeptid deformilázok: A deformilálás kritikus lépés a bakteriális fehérje-szintézisben, Pdf esszenciális a baktérium növekedéséhez. Jól konzervált sok patogén esetében. Actinonin - természetben előforduló antibiotikum, Pdf-et gátolja több patogén baktériumban (de nem jó a farmakokinetikája) Zsírsav bioszintézis: Zsírsav bioszintézis: Baktérium - de novo zsírsav bioszintézis több enzimmel Emlős - FAS (fatty acid synthase) komplex Kettő közt alacsony szekvencia-homológia  szelektív inhibítorok (isoniazid, thiolactomycin)

9 Antimikrobiális szerek fejlesztése a bakteriofágok genomjának segítségével

10 Staphylococcus aureus  nosocomális fertőzések  vancomicin, methycillin rezisztencia  megszekvenált genom - esszenciális gének azonosítása - hőmérséklet-szenzitív - hőmérséklet-szenzitív mutánsok vizsgálata mutánsok vizsgálata - gén inaktiválási vizsgálatok - gén inaktiválási vizsgálatok  új targetek  új targetek  26 Staphylococcus aureus fág vizsgálata  31 polipeptid család -bakteriális növekedést gátolták

11 Bakteriofágok: - bakteriális fehérjék inaktiválása - metabolikus folyamatok gátlása - metabolikus folyamatok gátlása 77-es fág ORF104 és DnaI kölcsönhatása  kis molekulájú inhibítorok hatása  kis molekulájú inhibítorok hatása

12 S. aureus fág genom 150 dsDNS bakteriofág vizsgálata: Lítikus hatás 3 csoport <20 kbp (p68 fág C1) ~40 kbp (77-es fág B1/B2) >100 kbp (G1 fág A1) Funkcionális screenelés: 77-es fág - Arzenit indukálható promóter kontrollja alá helyezett fág ORF - S. aureus ars operonjáról - kis mennyiségű 77ORF104 termék esetén is gátlás - citolitikus polipeptidek (holin, amidáz) - több fág esetében is Dot screening

13 S. aureus DnaI 77ORF104 celluláris targetje 77ORF104 celluláris targetje DNS replikáció iniciációja DNS replikáció iniciációja 77ORF104-DnaI kölcsönhatás: 77ORF104-DnaI kölcsönhatás: DnaI azonosítása affinitás-kromatográfiával Élesztő 2 hibrid analízis Far-western analízis

14 DnaI esszenciális S. aureusban RpLLReDnaI - genetikailag módosított törzs Spac promóter RN kontroll törzs pMJ8426 plazmid - LacI-t konstitutívan expresszál

15 77ORF104 expresszió gátolja a DNS szintézist direkt és specifikus direkt és specifikus interakció DnaI-vel interakció DnaI-vel ORF67 ORF67 RNS szintézist gátol RNS szintézist gátol

16 Antimikrobiális szerek hatása DnaI-re  vegyület tesztelése elérhető könyvtárakból  36 hatással volt a DnaI- 77ORF104 kölcsönhatásra  11 igen hatásosan gátolta a bakteriális növekedést

17 Összefoglalás  DnaI és DnaN  Sok potenciális target a DNS replikációs folyamatban  Antimikrobiális hatású fág ORF-ek azonosítása  További, DnaI-hez hasonló proteinek azonosítása  Screening: fág ORF-fel bakteriális target azonosítása  Kis molekulájú inhibítorok  További patogének vizsgálata: - Streptococcus pneumoniae - Pseudomonas aeruginosa

18 Köszönöm a figyelmet!


Letölteni ppt "Antibiotikumok fejlesztése a genomika segítségével Készítette: Terecskei Kata IV.biológus."

Hasonló előadás


Google Hirdetések