Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

FEHÉJE INTERAKCIÓN ALAPULÓ TECHNIKÁK Buday László.

Hasonló előadás


Az előadások a következő témára: "FEHÉJE INTERAKCIÓN ALAPULÓ TECHNIKÁK Buday László."— Előadás másolata:

1 FEHÉJE INTERAKCIÓN ALAPULÓ TECHNIKÁK Buday László

2 TAP-CÍMKE FEHÉRJE TISZTÍTÁS -- az eljárást Rigaut és mtsai fejlesztették ki (Nature Biotechnology, 1999, 17: ) TAP = tandem affinity purification -- a vizsgálandó fehérje mellé két „tag-ot” v. címkét helyezünk (akár C- akár N-terminálisan), melyek a protein A IgG-kötő részét, illetve egy calmodulin -kötő peptidet (CBP) jelentik -- ezeknek a címkéknek a segítségével jó hatásfokkal lehet a vizsgálandó fehéréjét, illetve fehérje komplexeit izolálni

3

4 TAP-CÍMKÉVEL JELÖLT FÚZIÓS FEHÉRJE FELÉPÍTÉSE protein ACBP vizsgálandó fehérje vagy doménje TAP-címke TEV proteáz hasítási helye asszociálódó fehérje

5 TAP-CÍMKE TISZTÍTÁSI STRATÉGIA TAP-címkével jelölt fehérjét tartalmazó sejt vagy állat előállítása Sejtkivonat előállítása TAP fehérje tisztítás SDS-poliakrilamid Funkcionális analízis gélelektroforézis (pl. enzimaktivitás mérés) Fehérje azonosítás (pl. tömeg-spektroszkópiával)

6 TANDEM AFFINITÁS KROMATOGRÁFIA KIVITELEZÉSE IgG gyantát tartalmazó kromatográfiás oszlop IgG sejtkivonat TEV proteáz IgG oszlopról eluált fehérjék EGTA átfolyó fehérjék fehérjék eluálása átfolyó fehérjék fúziós fehérjénk eluálása IgG prot. A CBP fehérje CBP fehérje Ca 2+ Kalm. Kalmodulin gyantát tartalmazó kromatográfiás oszlop Kalm. CBP fehérje CBP fehérje

7 TAP-TAG-Vav2 EXPRESSZIÓJA Cos7 SEJTEKBEN Anti-nyúl másodlagos ellenanyag + HRP TAP-TAG-Vav2 kontrol Vav2 plazmid

8 TAP-TAG-VAV2 TISZTÍTÁSA COS7 SEJTEKBŐL TAP-TAG-VAV kontrol Vav2 plazmid kb tranziensen transzfektált COS7 sejtből izoláltuk a TAP-tag Vav2-t ( 3 db 15 cm-es Petri-csésze) Festés: colloidális Commassie-kék

9 ÉLESZTŐ KÉT-HIBRID MÓDSZER Alapelve: a legtöbb eukarióta transzkripciós faktor két fehérje doménből áll: DNS-kötő domén (DKD) aktivátor domén (AD) A DNS-kötő domén a specifikus promóter szekvenciákhoz kötődik, míg az aktivátor domén az RNS polimeráz II-t viszi a promóter részhez Fontos: a két domén csak együtt tud transzkripciót elindítani, viszont megőrzik aktivitásukat, ha más fehérjével fúzionáltatjuk őket TF-kötő DNS promóter szakasz Reporter gén transzkripció DKD AD polimeráz Transzkripciós Faktor (TF) pl. GAL4

10 TF-kötő DNS promóter szakasz Reporter gén transzkripció DKD AD polimeráz MI TÖRTÉNIK, HA A TRANSZKRIPCIÓS FAKTOR KÉT DOMÉNJÉT KETTÉVÁGJUK, S EGY-EGY PLAZMIDDAL JUTATJUK BE A CÉLSEJTBE? Plazmid I., mely DKD-t tartalmazza Plazmid II., mely az AD-t tartalmazza

11 TF-kötő DNS promóter szakasz Reporter gén transzkripció DKD AD polimeráz Plazmid I., mely DKD-t és egy csali- fehérje génjét tartalmazza Plazmid II., mely az AD-t és egy expressziós könyvtár génjeit tartalmazza csali fehérje könyvtár A TRANSZKRIPCIÓS FAKTOR KÉT KETTÉVÁGOTT DOMÉNJÉHEZ KÜLÖN-KÜLÖN TETSZŐLEGES FEHÉRJÉKET LEHET KÖTNI

12 TF-kötő DNS promóter szakasz Reporter gén transzkripció DKD AD polimeráz Plazmid I., mely DKD-t és egy csali- fehérje génjét tartalmazza Plazmid II., mely az AD-t és egy expressziós könyvtár génjeit tartalmazza csali fehérje könyvtár HA A CSALIFEHÉRJE KÖTŐDNI TUD AZ EXPRESSZIÓS KÖNYVTÁR EGYIK FEHÉRJÉJÉHEZ, AKKOR MEGINDUL A TRANSZKRIPCIÓ

13 cDNS expressziós könyvtár egyes klónjai petri csészén A pirossal jelzett klónokban a csali fehérje kötődni tudott az éppen az abban a klónban expresszálódó fehérjéhez, s a riporter gén „megszólalt” Izolálni kell a kiválasztott klónt, s szekvenálni a benne lévő cDNS darabot

14 GLUTATION-S-TRANSZFERÁZ (GST) EXPRESSZIÓS RENDSZER --- Tetszőleges fehérje, vagy fehérje domén nagy mennyiségben E. coli-ban történő expresszálására pGEX Lac inhibitor gén Ampicillin rezisztencia gén Lac promóter GST Polilinker v. Multicloning site Ori Represszor fehérje IPTG

15 GST és X FEHÉRJÉT TARTALMAZÓ VEKTOR pGEX Ampicillin rezisztencia gén GST Ori Lac promóter X vizsgálandó fehérje génje GST X FEH. GST FÚZIÓS FEHÉRJE

16 GST-X FÚZIÓS FEHÉRJE TISZTÍTÁSA BAKTÉRIUMBÓL AFFINITÁS KROMATOGRÁFIA SEGÍTSÉGÉVEL Sepharose matrix GLUTATION GST X FEH. GST X FEH. A baktérium kivonatához glutationt adunk, mely kovalensen van kötve valamilyen gyantához Enzim-szubsztrát kölcsönhatás Ha megmossuk a gyantát akkor a bakteriális fehérjéket el lehet távolítani

17 GST-FÚZIÓS FEHÉRJE ELUÁLÁSA AZ OSZLOPRÓL NAGY FELESLEGBEN ADOTT SZABAD GLUTATIONNAL TÖRTÉNIK Sepharose matrix GLUTATION GST X FEH. GLUTATION GST X FEH. GLUTATION A felesleges glutation dialízissel lehet eltávolítani.

18 X-FEHÉRJE EMÉSZTÉSE A GST FEHÉRJÉRŐL Sepharose matrix GLUTATION GST X FEH. GST X FEH. Trombin hasítási hely található a GST és a X fehérje között. X FEH.

19 PÉLDA A GST-FEHÉRJÉK ALKALMAZÁSÁRA FEHÉRJE-FEHÉRJE INTERAKCIÓK KAPCSÁN Korábban kimutattuk, hogy az NCK kapcsoló fehérje megköti a dinamint. Utóbbi fehérjének fontos szerepe van számos receptor down-regulációjában, illetve az endocitózisban. SH3 SH2 NCK szerkezete dinamin ? ? ? A dinamin képes az NCK egyik SH3 doménjéhez kötődni, de melyikhez?

20 SH3-1SH3-2SH3-3SH2 PCR SEGÍTSÉGÉVEL ELKÉSZÍTETTÜK AZ EGYES SH3 DOMÉNEKET TARTALMAZÓ GST FÚZIÓS FEHÉRJÉKET SH3-1GST SH3-2GST SH3-3GST Nck SH3 domének PCR-e pGEX SH3-1 SH3-2 SH3-3

21 AZ EGYES GST-SH3 DOMÉN FEHÉRJÉK TISZTÍTÁS UTÁNI KÉPE SH3-1 SH3-2 SH3-3 Az egyes SH3 doméneket tartalmazó GST fúziós fehérjéket Glutation-Sepharoz affinitás oszlopon megtisztítottuk, majd a GST fehérjéket SDS-poliakrilamid gélelektroforézissel elválasztottuk. A fehérjéket Coomassie-kék festékkel tettük láthatóvá. SH3-1 SH3-2 SH3-3 Nck

22 A DINAMIN AZ NCK HARMADIK SH3 DOMÉNJÉHEZ KÖTŐDIK Anti-dinamin Western-blot Kísérlet rövid leírása: Az elkészített GST-SH3 doméneket Glutation-Sepharose gyantám hagytuk a tisztítást követően. A gyantákat sejtkivonatba mártottuk, majd alaposan megmostuk, s anti-dinamin Western-blottal vizsgáltuk, hogy melyik SH3 domén köti a dinamint.

23 ZÖLD FLUORESZKÁLÓ FEHÉRJE RENDSZER (Green fluorescence protein, GFP) GFPvizsgálandó fehérje -- egy medúza fajból izolált természetes fluoreszkáló fehérje -- pontmutációk segítségével fokozni lehet a fluoreszcenciát (EGFP = enhanced green fluorescence protein) -- a vizsgálandó fehérje N- és C-terminálisához egyaránt hozzá lehet fűzni -- lehetőséget biztosít a vizsgálandó fehérje élő sejten belüli követésére -- a GFP rendszer kimeríti mind expressziós rendsz, mind a riporter rendszer, mind az epitóp-címkézés fogalmát, ugyanis kiváló mono- lonális ellenanyag kapható a GFP rész ellen

24 pEGFP vektorok (Clontech cégtől) GFPfehérjeGFPfehérje N-terminális GFP C-terminális GFP

25 GFP-Vav2 EXPRESSZIÓJA ÉS HATÁSA AZ AKTIN CITOSZKELETONRA COS7 SEJTEKBEN GFP GFP-Vav2 TRITC- Phalloidin TRITC- Phalloidin

26 GFP FÚZIÓS FEHÉRJÉKKEL ELKERÜLHETŐ A WESTERN-BLOTTAL VALÓ MUNKA SDS-poliakrilamid gélelektoforézis ugyanis a gélt elég floureszcencát mérni tudó Gél-dok rendszerbe beletenni: a GFP fehérjék világítani fognak

27 FAR-WESTERN-BLOT TECHNIKA A hagyományos Western-blot eljárás módosított változata, mely fehérje- fehérje interakciók kimutatására szolgál. Lényege: a fehérje elegyet a szokásos módon SDS-poliakrilamid gél- elektroforézis segítségével elválasztjuk, majd a fehérjéket membránra (PVDF, nitrocellulóz) blottoljuk át. Itt azonban nem az átblottolt fehérjéket mutatjuk ki elsődleges, illetve másodlagos ellenanyagok hozzáadásával, hanem a blottolást követően egy szolubilis fehérjével inkubáljuk a membránt, ami kötődik az általa felismert fehérjékhez. Ez után a szolubilis fehérje elleni elsődleges, majd másodlagos ellen- anyagok segítségével detektálhatjuk azokat a membránhoz-kötött fehérjéket, melyekhez a szolubilis fehérje kikötődött.

28 FAR-WESTERN-BLOT MENETE SDS-PAGE gél Nitrocellulóz membrán blottolás

29 INKUBÁLÁS SZOLUBILIS FEHÉRJÉVEL Nitrocellulóz membrán Kötődik az egyik fehérjéhez a membránon

30 A SZOLUBILIS FEHÉRJE KIMUTATÁSA ELLENANYAGOKKAL Inkubálás elsődleges ellenanyaggal Inkubálás másodlagos ellenanyaggal torma peroxidáz

31 KO-IMMUNPRECIPITÁCIÓS TECHNIKA A legtöbb fehérje a sejtben más fehérjékhez kötve helyezkedik el. Ha a komplex egyik fehérjéje ellen termelt ellenanyaggal immun- precipitáluk a fehérjét, megfelelő körülmények között a komplex többi tagja is immunprecipitálódni fog. A B C Protein A Sepharose gyanta anti-C elleni ellenanyag

32 PÉLDA A KO-IMMUNPRECIPITÁCIÓRA SOS Grb2 SH3 EGF receprtor SH2 P SH3


Letölteni ppt "FEHÉJE INTERAKCIÓN ALAPULÓ TECHNIKÁK Buday László."

Hasonló előadás


Google Hirdetések