ELVÁLASZTÁSTECHNIKA IV. HIDROFÓB KÖLCSÖNHATÁSÚ FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA AFFINITÁSI KROMATOGRÁFIA Dr. Kremmer Tibor EÖTVÖS LORÁND TUDOMÁNY EGYETEM Budapest

HIDROFÓB KÖLCSÖNHATÁSÚ KROMATOGRÁFIA HYDROPHOBIC INTERACTION CHROMATOGRAPHY (HIC)

TÖRTÉNETI ÁTTEKINTÉS 1971 Affinitási kromatográfiás tölteteknél spacer alkalmazásakor zavaró másodlagos kölcsönhatásokat figyelnek meg 1972  Shaltiel Hydrophobic Chromatography Spacer-ligandumként, agaróz hordozóra alkilaminokat alkalmaz 1973 Hjerten Hydrophobic Interaction Chromatography Porath Hydrophobic Salting-out Chromatography Kozmotróp sók adagolásával a fehérjék retenciója nő Hoftsee Hydrophobic Adsorption Chromatography A ligandum szénláncának növelése és sűrűségének csökkentése növeli az eljárás felbontóképességét 1976 Morris HIC (Trends Biochem Sci.) 1980 - HPLC töltetek 5-10 m szemcseméret (analitikai) 20-40 m szemcseméret (preparatív), pórusméret növelése (300Å) 1986 Nem porózus töltetek (1-3 um) Perfúziós töltetek (200 és 300-500 nm pórus)

HIDROFÓB KÖLCSÖNHATÁSÚ FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA (HIC) matrix spacer protein ligandum (domain)

HIDROFÓB KÖLCSÖNHATÁSÚ FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA (HIC) KÜLÖNBÖZŐ LIGANDUMOK HATÁSA A RETENCIÓRA (Gooding et al. 1984) OH-Propil → Propil → Benzil → i-Propil → Fenil → Pentil  a retenció növekedése 

KÜLÖNBÖZŐ ANIONOK ÉS KATIONOK HATÁSA A HIDROFÓB KÖLCSÖNHATÁSRA PO43- ~ SO42- ~ CH3COO- ~ Cl- ~ Br- ~ NO3- ~ CIO4- ~ SCN- növekvő besózó - csökkenő kisózó hatás növekvő kaotrop - csökkenő kozmotrop hatás NH4+ ~ Rb+ ~ K+ ~ Na+ ~ Cs+ ~ Li+ ~ Mg2+ ~ Ca2+ ~ Ba2+ Phenyl-Superose, Pharmacia, Uppsala

SAVANYÚ ALFA-1-GLIKOPROTEIN (AGP) ÉS ALFA-1-ANTITRIPSZIN (AAT) (NH4)2SO4 1,5 M HUMÁN SZÉRUM SAVANYÚ ALFA-1-GLIKOPROTEIN (AGP) ÉS ALFA-1-ANTITRIPSZIN (AAT) ELVÁLASZTÁSA ÉS TISZTÍTÁSA HIDROFÓB KÖLCSÖNHATÁSÚ KROMATOGRÁFIÁVAL Fractogel EMD Propyl oszlop (10x1 cm, 20-40 m) Eluens A – 20 mM Na-foszfát, pH : 7,2 1,1 M NH4-szulfát Eluens B - 20 mM Na-foszfát, pH : 7,2 Lineáris gradiens elúció Áramlási sebesség : 1 mL/perc Detektálás : 278 nm (Oláh, Kremmer, Boldizsár, J. Chromatogr. 2000)

REFERENCIA FEHÉRJÉK ELVÁLASZTÁSA HIDROFÓB KÖLCSÖNHATÁSÚ FOLYADÉKKROMATOGRÁFIÁVAL (NH4)2SO4

FEHÉRJÉK OVALBUMINRA VONATKOZTATOTT RELATIV RETENCIÓK PROTEIN RRT HIDROFÓB KÖLCSÖNHATÁSÚ KROMATOGRÁFIA FEHÉRJÉK OVALBUMINRA VONATKOZTATOTT RELATIV RETENCIÓK PROTEIN RRT Cytochrome C 0.59 Myoglobin 0.73 Ribonuclease A 0.76 Haemoglobin 0.91 Albumin (human) 0.94 Ovalbumin 1.00 Trypsinogen 1.02 Transferrin 1.07 Lysozyme 1.08 Albumin (bovine serum) 1.11 a-Chymotrypsinogen A 1.12 Pepsin 1.15 Trypsin inhibitor 1.23

Hydrophobic Interaction Chromatography of Proteins Column A: Progel-TSK Butyl-NPR, 3.5cm x 4.6mm ID, 2.5μm particles Column B: Progel-TSK Phenyl-SPW, 7.5cm x 7.5mm ID, 10 μm particles Column C: ProgeI-TSK Ether-5PW, 7.5cm x 7.5mm ID, 10 μm particles Mobile Phase: A - 0.1M phosphate buffer, pH 7.0 and 2.3 → 0M ammonium sulfate (12 min) B - C = 0,1M phosphate buffer, pH 7.0 and 1.8 → 0M ammonium sulfate (60 min) Flow rate: 1mL/min; Temp.: 250 C; Detection: UV 280 nm Samples: 1.  Myoglobin, 2. Ribonuclesae, 3. Lysozyme, 4. -Chymotrypsin, 5.   -Chymotrypsinogen

 hidrofób kölcsönhatások A HIDROFÓB KÖLCSÖNHATÁSÚ KROMATOGRÁFIA ALAPJAI A FEHÉRJÉK SZORPCIÓJA ÉS RETENCIÓJA II. SÓK HATÁSA A FEHÉRJÉK OLDÓDÁSÁRA 1 - Kis sókoncentrációk - ionos kölcsönhatások - stabilizálás 2 - Nagy sókoncentrációk - speciális kölcsönhatások, kozmotróp sópárok, pl. (NH4)2SO4 - stabilizálás, majd kicsapódás,  hidrofób kölcsönhatások

HIC - TERVEZÉS

A HIDROFÓB KÜLCSÖNHATÁSÚ (HIC) ÉS FORDÍTOTT FÁZISÚ KROMATOGRÁFIA (RPC) ÖSSZEHASONLÍTÁSA Mindkét technikában közös és jellemző: - Az álló fázis a hordozóra kötött apoláris ligandum. - A szorpció oka a hidrofób (apolárIs) kölcsönhatás. - A retenciót döntő módon a hidrofóbicitási viszonyok határozzák meg. - Mindkét technika alkalmas a fehérjék elválasztására.

a HIC esetében az áramló fázis (eluens) a domináns tényező A HIDROFÓB KÖLCSÖNHATÁSÚ (HIC) ÉS A FORDÍTOTT FÁZISÚ KROMATOGRÁFIA (RPC) KÜLÖNBSÉGEI - A HIC liganduma gyengébben apoláris, kisebb a felületi koncentrációja. A HIC esetén sokkal gyengébb a szorpció, a fehérje natív formában (folded) marad, kisebb a denaturáció esélye. A RPC esetében az erős szorpció megszüntetheti az eredeti struktúrát (unfolding), itt a retenciót elsősorban az elsődleges szerkezet hidrofób jellege határozza meg. - A RPC esetében a fehérje spontán kötődik a ligandumhoz. Az elúciót szerves oldószer adagolása okozza. A HIC esetében a fehérje kötődése a tölteten és a retenció mértéke a kozmotróp só adagolásával érhető el. Az elúció a só negatív koncentráció gradiensének eredménye. A RPC esetében a hidrofób kölcsönhatásért döntően az álló fázis (ligandum) felelős, a HIC esetében az áramló fázis (eluens) a domináns tényező

I. FEHÉRJÉK "VIZES" KÖZEGBEN A HIDROFÓB KÖLCSÖNHATÁSÚ KROMATOGRÁFIA ALAPJAI A FEHÉRJÉK SZORPCIÓJA ÉS RETENCIÓJA I. FEHÉRJÉK "VIZES" KÖZEGBEN A fehérjék fiziológiás körülmények (pH, ionerősség) között harmadlagos ill. negyedleges szerkezettel (folded) rendelkeznek. A fehérjék apoláros karakterű aminosav összetevői (Ala, Val, Leu, Tyr, Trp, Phe) a szerkezet belsejébe törekszenek, egy részük azonban a felületre kényszerül (hydrophobic patch). Ez kb. a felület 40%-át képezi, és fontos funkcionális szerepe van a fehérje biológiai aktivitásában. Frank és Evans (1945) feltételezték, hogy vizes oldatokban a víz molekulái un. "icebergs" formában fedik a hidrofób felületeket. Némethy és Sheraga (1962) szerint két hidrofób anyag vizes oldatban létrejövő kapcsolata során a víz jégszerű struktúrája mintegy feloldódik és dezorganizálódik (entrópia nő – az energia felszabadulás fedezi az asszociáció energiaigényét) Vizes oldatokban ezek az erők stabilizálják a fehérjék natív szerkezetét. A fehérjék a vizes (fiziológiás) közegben általában jól oldódnak (stabilak) és nem törekszenek hidrofób kapcsolatokra.

III. SÓK HATÁSA A FEHÉRJÉK OLDÓDÁSÁRA A HIDROFÓB KÖLCSÖNHATÁSÚ KROMATOGRÁFIA ALAPJAI A FEHÉRJÉK SZORPCIÓJA ÉS RETENCIÓJA III. SÓK HATÁSA A FEHÉRJÉK OLDÓDÁSÁRA Melander és Horváth (1977) SZOLVOFÓB ELMÉLET - Az oldódás során az oldószer az oldandó anyagot befogadó üreget (cavity) képez. - Az oldhatóság a határfelületi szabadenergia megváltozásának a függvénye, ami az oldószer felületi feszültségétől függ. - Az oldat só koncentrációjának (m) növelésével az oldat felületi feszültsége arányosan változik: V = Vo + c . R . m R - a víz felületi feszültsége c - a só moláris felületi feszültség inkrementuma - c korrelációba hozható a sók (anionok) liotróp sorával (Hofmeister l888). - Az elmélet a hidrofób kromatográfiás gyakorlat számára legegyszerűbb formájában a retenció kifejezésére alkalmas össszefüggést (lnk - m) ad. A kapacitási faktor logaritmusa (lnk) a következő egyenlettel fejezhető ki : ln k = ln kviz + S. m az egyenes tengelymetszete (elvileg) a tiszta vízben mérhető kapacitási faktor logaritmusa. - A konkrét mérések az elmélet számos bizonytalanságára hívják fel a figyelmet.

PREFERENTIAL INTERACTION ELMÉLET Timasheff (1959) Arakawa és Timasheff (1982) -  Egy egyensúlyi rendszerben lévő oldathoz adott komponens megváltoztatja a fennálló egyensúlyt. -  Az új komponens nem egyforma mértékben lép kölcsönhatásba a már ott lévő komponensekkel (preferentíal interaction), ezt fejezi ki a preferential interaction paraméter (PIP). -  Mérése a szabadentalpia vagyis a kémiai potenciál változásának mérésével lehetséges, ez arányos a felületi feszültség változással. -  Megállapították, hogy a kisózószerek (kozmotróp sók) a fehérjék környezetében negatív PIP értékkel bírnak, vagyis kizáródnak a fehérjék közeléből. Ennek eredménye egy többlet hidratáció, amely a fehérje kémiai potenciálját megnöveli végezetül kicsapódáshoz vezet. -  A só-fehérje kölcsönhatás két ellentétes hatás eredője: 1. kedvezőtlen felületi feszültség változás 2. kedvező só kötődés A kisózó szerek esetében az első hatás a domináns (egyértékű kationok sói), a besózó szerek esetében a második kompenzálja az elsőt.

A ligandum szerkezetének szerepe az albumin kötödésében a hidrofób kölcsönhatású kromatográfiában

AFFINITÁSI KROMATOGRÁFIA AFFINITY CHROMATOGRAPHY

AFFINITÁSI KROMATOGRÁFIA ALAPELV Kovalens kötéssel (általában köztes láncon keresztül - spacer, leash, tentacle) hordozó szemcsékre (mátrix) rögzített különböző funkcionális csoportok (ligandum), amelyek Az elválasztandó (bio)molekulával specifikus és reverzibilis kölcsönhatásokat képeznek. Mátrix: - Poliszacharidok: agaróz                     (Sepharose, Superose) cellulóz - Organikus polimerek: poliakrilamid hidroxialkil metakrilát (Spheron) etilénglikol metakrilát (Fractogel) - kevert agaróz-poliakrilamid        (Ultrogel) - Silica, "porózus üveg"                (SelectiSphere)

AFFINITÁSI KÖLCSÖNHATÁSOK (IMMOBILIZED LIGAND AFFINITY TECHNIOUES) IMMUNOAFFINITY (immunosorption) LECTINS (glycoproteins, oligo-polysaccharides) HORMONES (receptors/carriers/antihormones) PROTEINS (enzymes, immunoglobulins) SUBSTRATES (cofactors, inhibitors, modulators) NUCLEIC ACID binding ligands (oligo(dT)cellulose) VÍRUS binding ligands PHENYL BORONATE binding (cis-diols) IMMOBILIZED METAL ION binding affinity DYE-LIGAND binding affinity - Cibacron Blue F3G-A - Malachit Green (A/T specific) - Phenol Red (G/C specific)

FOR AFFINITY INTERACTIONS WITH GLYCOPROTEINS LECTINS FOR AFFINITY INTERACTIONS WITH GLYCOPROTEINS With N-linked sugars Lectin-AAA Lectin-DSA Lectin-GNA Lectin-MAA Lectin-SNA Lectin-PHA-L Specificity for structures L-Fuc(l-6)GIcNAcl Galβ(l-4)GlcNAc- Man (l-3)62 Man- SA (2-3)Gal SA (2-6)Gal Poly-Gal-GlcNAc- With O-linked sugars Lectin-ACA Lectin-PNA Lectin-ConA Lectin-RCA-120 Lectin-WGA SA(2-3)Galβ(l-3)-GalNAc-Ser/Thr Galβ(l-3) GalNAc-Ser/Thr

Ready-to-use group specific adsorbents AFFINITÁSI KROMATOGRÁFIA Ready-to-use group specific adsorbents Product Specificity Applications Eluents Protein A-Sepharose CL-4B Fc region of IgG IgG (many species), IgG subclasses and fragments immuno complexes, antigens 1 M HAc, pH 3 0,1 M glycyltyrosine, pH 7 Con A-Sepharose -D-glucosyl, -D-mannosyl residues Glycoproteins, membrane proteins, glycolipids, polysaccharides Free sugar (methyl-  -D-glucoside); pulse or gradient (0-0.5 M). Decreased pH (not below 3) Borate buffer (0.1 M, pH 6.5) Lentil Lectin-Sepharose 4B Similar to Con A (weaker affinity) Membrane proteins, glycoproteins Free sugar (methyl-  -D-glucoside); pulse or gradient (0-0.1 M) Wheat germ Lectin-Sepharose 6MB N-acetyl-β-D-glucos-aminyl residues Glycoproteins, polysaccharides, cells (esp. T-lymphocytes) Free sugar (N-acetyl- β -D-glucos-amine); pulse or gradient. Helix pomatia Lectin-Sepharose 6MB N-acetyl-  -D galactos-aminyl residues cells (esp. T-lymphocytes), glycoproteins Free sugar (N-acetyl-  -D-galactosamine)

Sejtmembrán glikoprotein (Na-deoxikolát extraktum) tisztítása L. culinaris lectin-Sepharose 4B oszlopon

FESTÉK LIGANDUM AFFINITÁSI KROMATOGRÁFIA DYE-LIGAND AFFINITY CHROMATOGRAPHY

DYE-LIGAND AFFINITY CHROMATOGRAPHY OF HUMAN SERUM PROTEINS FUNCTIONAL GROUP: CIBACRON BLUE F3G-A AFFINITY PACKING MATERIALS: (Capacities  10 mg albumin per ml gel) ~ Blue Sepharose CL-6B (Pharmacia) ~ Affi-GelR Blue Gel           (Bio-Rad) ~ Fractogel TSK AF-Blue (Merck), TOYOPEARL AF Blue HC-650M COLUMN: 6x0.5cmI.D. (Pharmacia 5/5) CHROMATOGRAPHIC SYSTEM: FPLC (Pharmacia) with LCC-500 Programmer and UV-1 Monitor (278 nm) ELUTION: Equilibrated and eluted with 10 mM phosphate buffer pH: 5.8 or 6.8 Step gradient elution with 10 mM phosphate buffer pH:8.0 containing 2 M NaCl FLOW RATE: 1 ml / min SAMPLE: 500 μL ~ prepared by Sephadex G-25 Equivalent to 50 μL of original serum

DYE-LIGAND AFFINITY CHROMATOGRAPHY OF HUMAN SERUM PROTEINS COLUMN: Blue Sepharose CL-6B pH:5,8 Human serum samples prepared by Sephadex G-25

FENIL BORONÁT AFFINITÁSI KROMATOGRÁFIA

PSEUDO-URIDIN MEGHATÁROZÁSA HUMÁN VIZELETBEN

PSEUDO-URIDINE DETERMINATION PRINCIPLE NUCLEOSIDES (PSEUDO-URIDINE) WITH VICINAL HYDROXYL GROUPS IN THEIR STRUCTURE CAN BE EXTRACTED SELECTIVELY BY AFFINITY CHROMA-TOGRAPHY FROM COMPLEX BIOLOGICAL SAMPLES AND SEPARATED BY REVERSED-PHASE HPLC. SAMPLE PREPARATION MICRO-PREPARATIVE BORONATE AFFINITY COLUMN (Affi-Gel 601, Bio-Rad Labs, 5x50 mm) WAS EQULIBRATED WITH 0.25M NH4-ACETATE (pH 8-8). ONE ml URINE WAS MIXED WITH 0.3 ml 2.5M NH4-ACETATE (pH 9.5) AND CENTRIFUGED. 500 μL SUPERNATANT WAS APPLIED ON THE AFFINITY COLUMN AND WASHED WITH 2x4 ml 0.25M NH 4 - ACETATE (pH 8.8). ELUTION WAS PERFORMED WITH 5 ml 0.1M FORMIC ACID. ELUATE WAS COLLECTED AND FREEZE-DRYED. THE RESIDUE WAS SOLVED IN 250 μL 10mM NH4~PHOSPHATE (pH 5) CONTAINING 2 % METHANOL. HPLC ANALYSIS HP 1084B LIQUID CHROMATOGRAPH ISOCRATIC ELUTION WITH 10mM PHOSPHATE BUFFER (pH 5.1) CONTAINING 2% (v/v) METHANOL., COLUMN: ODS-HYPERSIL (25x0.46 cm, 5u) TEMP: 35°C. FLOW: 1 ml/min. DETECTION: 254 nm.