Elválasztástechnikai Kutató és Oktató Laboratórium

Az előadások a következő témára: "Elválasztástechnikai Kutató és Oktató Laboratórium"— Előadás másolata:

1 Elválasztástechnikai Kutató és Oktató Laboratórium
kv1n1lv1 Bemutatkozás

2 Tételek A kromatogram és kromatográfiás csúcs főbb jellemzői, tányérelmélet A gázkromatográfiás rendszer felépítése, a gázkromatográfia állófázisai Mintabevitel a gázkromatográfiában A gázkromatográfia mozgófázisai, sebességi elmélet Gázkromatográfiás detektorok (kivéve MS) Tömegspektrometriás detektálás a gázkromatográfiában Minta-előkészítés Elektromigrációs módszerek A HPLC-s rendszer felépítése, az egyes elemek szerepe és működése A folyadékkromatográfiás állófázisok fajtái, jellemzése A folyadékkromatográfiás mozgó fázisok és a gradiens elúció Normál fázisú folyadékkromatográfia Fordított fázisú folyadékkromatográfia MIP, affinitáskromatográfia és gélkromatográfia, HIC, HILIC Ionos összetevők elválasztására alkalmas folyadékkromatográfiás módszerek Folyadékkromatográfiás detektorok (kivéve MS) Tömegspektrometriás detektálás a folyadékkromatográfiában

3 Izokratikus ill. gradiens elúció
tR (min) mAU GRADIENS tR (min) mAU

4 Gradiens elúció

5 Performance Parameters for HPLC pumps: Flow Precision Flow Range
Pump summary The pump is the most critical piece of equipment for a successfully operating HPLC. Performance Parameters for HPLC pumps: Flow Precision Flow Range Delay Volume Pressure Pulse Composition Precision

6 MIP-Molecularly Imprinted Polimer
Célvegyület Célvegyület Monomerek Elrendeződés Polimerizáció (UV vagy T) Célvegyület Extrakció MIP - célvegyület

7 Affinitás kromatográfia
Állófázis (mátrix) 90%-ban agar-agar gél, a többi sephadex gél, cellulóz származékok vagy egyéb polimer. ligandum távtartó + + + + + + + +

8 Nincs kölcsönhatás a minta-molekula és az állófázis között!!
Gélkromatográfia Gél szemcse Pórusok (dp> 100A) Állófázis a kolonnában Nincs kölcsönhatás a minta-molekula és az állófázis között!! Eltérő méretű molekulákból álló minta

9 Teljes áteresztési tartomány Mérési tartomány
Gélkromatográfia Teljes kizárási tartomány- az a nagyobb molekulaméret amelynél nincs visszatartás (holt térfogat); Mérési (működési) tartomány - az a molekulaméret, amelynél van visszatartás; Teljes áteresztési tartomány – nagyon kis molekulák, amelyek teljesen átjárják a pórusokat (a retenciós idő konstans); Teljes áteresztési tartomány Mérési tartomány Teljes kizárási tartomány lgM V (ml)

10 Ismétlés vége

11 Ionpár fordított fázisú folyadékkromatográfia

12 Ionpár fordított fázisú folyadékkromatográfia
Ionpárképző reagens (Quaterner alkil ammónium só) N+ Ion-párképző só [Molekula ION]- Mérendő komponens ionos formája C18 szilárd fázis N+ [Molekula ION]-

13 Ionpár fordított fázisú folyadékkromatográfia
Ionpárképző reagens (Alkil szulfonsav só) Ionpárképző só S O O- [Molekula ION]+ Mérendő komponens ionos formája C18 szilárd fázis O S [Molekula ION]+ O- Esetleg: CF3COO-; BF4-; ClO4-, PF6-

14 Ionpárképző mechanizmus (ioncserés modell)
Na+ [ION]+ SO3-Na+ SO3- SO3-Na+ Módosított állófázis C18 szilárd fázis

15 Ionpár fordított fázisú folyadékkromatográfia
Az RP-IP_HPLC-ben változtatható paraméterek: Ionpárképző koncentrációja; Ionpárképző jellege (típusa, lánc hossza, stb.) Szerves modifikátor típusa, mennyisége; Puffer koncentrációja, pH-ja; Idegen só koncentrációja;

16 Ionpár fordított fázisú folyadékkromatográfia – a szerves fázis hatása

17 Ionpár fordított fázisú folyadékkromatográfia – ionpárképző típusa

18 Ionpár fordított fázisú folyadékkromatográfia – ionpárképző típusa
Idegen só hatásáról Tóninál van ábra

19 Ioncserés folyadékkromatográfia

20 Ioncserés folyadékkromatográfia
Ioncsere: ha az állófázis állandó töltéssel rendelkezik; Ioncserélő kapacitás: megkötött ellentétes ion mennyiség egységnyi tömegű tölteten (mmol/g vagy mekv./g); „Ioncserélő gyanták” Ionkizárásos kromatográfia Ionkromatográfia

21 AMFOTER (kevert) TIPUSOK
Ioncserélő töltetek KATION CSERÉLŐK Negatív töltésű funkcionális csoportokkal (szulfonil, karbonil, PO4-) ANION CSERÉLŐK Pozitív töltésű (primer, vagy szubsztituált, szekunder, tercier, kvaterner amino, imino, guanidil, stb.) funkcionális csoportokkal AMFOTER (kevert) TIPUSOK Pozitív és negatív töltésű funkcionális csoportokat tartalmazó komplex szerkezettel ERŐS - GYENGE IONCSERÉLŐK DISSZOCIÁCIÓ FOKA (pKA, pKK, pKI) SZERINT „TENTACLE” ELV - KAPACITÁS !

22 Ionkizárásos folyadékkromatográfia
Állófázis: nagy ioncserélő kapacitású anion vagy kation cserélő gyanta; Eluens: puffer (ritkán kis szerves oldószer tartalommal); Alkalmazásai: fermentlevek, szeszesital, üdítőital gyártás (cukrok, savak, alkoholok elválasztása) HOOC-R HO-R Cukor SO-3 SO-3 -OOC-R pórus

23 Állófázis: kis ioncserélő kapacitású anion vagy kation cserélő gyanta;
Ionkromatográfia A szervetlen anionok, kationok vagy vízben oldódó szerves savak és bázisok meghatározására használjuk Állófázis: kis ioncserélő kapacitású anion vagy kation cserélő gyanta; Eluens: puffer; Detektor: vezetőképesség (elektrokémiai) ionelnyomó után.

24 Ionkromatográfia Hordozó Típus Üveggyöngy ioncserélő bevonattal
Jellemzők Üveggyöngy ioncserélő bevonattal Filmszerű (37-44 mm) Gyors elválasztás, közepes hatékonyság, kis kapacitás, pH 2-8, szárazon töltik, könnyen beszennyeződik Szilikagél alapú Mikropórusos (10 nm) Közepes gyorsaság, leghatékonyabb, pH 2-8, pépes töltés Polisztirol Lassú, kis hatékonyságú, jó kapacitás, pH 0-12, pépes töltés

25 Visszatartást befolyásoló tényezők:
Ionkromatográfia Visszatartást befolyásoló tényezők: Növekvő pH Nő a savak ionizációja – nő a visszatartás; Csökken a bázikus vegyületek ionizációja – gyorsan eluálódnak; Puffer erősség nő Ioncserélő felületeken megnő a versengés – csökken a retenció; Nő a hőmérséklet Egyensúly kedvez a mozgó fázisnak – csökken a retenció.

26 Ionkromatográfia

27 Szupresszió előtt Vezetőképesség mS Szupresszió után Idő (min)
Ionkromatográfia Szupresszió előtt Szupresszió után Vezetőképesség mS Idő (min)

28 Az ionelnyomóban lejátszódó folyamatok (eluens NaHCO3):
Ionkromatográfia Szupresszió ioncserés oszloppal (Regenerálni kell!!) cél: a mozgófázis vezetőképességének csökkentése (S/N növelése) Cl- meghatározása    Az ionelnyomóban lejátszódó folyamatok (eluens NaHCO3): Gyanta-H+  + Na+ HCO3  --> Gyanta-Na+  + H2CO3 Gyanta-H+  + Na+ Cl-       -->  Gyanta-Na+  + HCl A mozgófázis vezetőképessége jelentősen csökken, az elválasztott ion vezetőképessége a Na ion (50 S*Cm2/equiv.) H ionnal (350 S*cm2/equiv.) történő cseréjével jelentősen megnő. Na+ meghatározása    Az ionelnyomóban lejátszódó folyamatok (eluens HCl): Gyanta-OH- + H+ Cl-  -->  Gyanta-Cl- +   H2O Gyanta-OH- + Na+ Cl- --> Gyanta-Cl- +   Na+ OH- A mozgófázisból víz lesz, a mintában pedig lecseréljük a Cl- (76 S*cm2/equiv) ionokat OH- ionokra (198 S*cm2/equiv).

29 Alkalmazás (Anion referencia oldat); 0,5M Na2CO3 és NaHCO3
Ionkromatográfia Alkalmazás (Anion referencia oldat); 0,5M Na2CO3 és NaHCO3 IonPac® AS14; 4*250mm oszlop és IonPac® AG14; 4*50mm előtétoszlop

30 Alkalmazás (vízminta); 0,5M Na2CO3 és NaHCO3
Ionkromatográfia Alkalmazás (vízminta); 0,5M Na2CO3 és NaHCO3 IonPac® AS14; 4*250mm oszlop és IonPac® AG14; 4*50mm előtétoszlop

31 Ionkromatográfia

32 IONCSERÉLŐ KROMATOGRÁFIÁS ELVÁLASZTÁSA
Ionkromatográfia 21 TERMÉSZETES AMINOSAV IONCSERÉLŐ KROMATOGRÁFIÁS ELVÁLASZTÁSA Dionex DC-6A ANIONCSERÉLŐN (30X0,46 cm) 3 LÉPÉSES Na-citrát gradiens DETEKTÁLÁS: NINHIDRIN (post-column)

33 Hidrofób kölcsönhatású kromatográfia
(Hidrophobic Interaction Chromatography, HIC)

34 Hidrofób kölcsönhatású kromatográfia

35 Hidrofób kölcsönhatású kromatográfia

36 Mindkét technikában közös és jellemző:
HIC vs. RPC Mindkét technikában közös és jellemző: - Az álló fázis a hordozóra kötött apoláris ligandum. - A szorpció oka a hidrofób (apolárIs) kölcsönhatás. - A retenciót döntő módon a hidrofóbicitási viszonyok határozzák meg. - Alkalmasak fehérjék elválasztására.

37 HIC vs. RPC KÜLÖNBSÉGEK: - A HIC liganduma gyengébben apoláris, kisebb a felületi koncentrációja. A HIC esetén sokkal gyengébb a szorpció, a fehérje natív formában (folded) marad, kisebb a denaturáció esélye. A RPC esetében az erős szorpció megszüntetheti az eredeti struktúrát (unfolding), itt a retenciót elsősorban az elsődleges szerkezet hidrofób jellege határozza meg. - A RPC esetében a fehérje spontán kötődik a ligandumhoz. Az elúciót szerves oldószer adagolása okozza. A HIC esetében a fehérje kötődése a tölteten és a retenció mértéke a kozmotróp só adagolásával érhető el. Az elúció a só negatív koncentráció gradiensének eredménye. A RPC esetében a hidrofób kölcsönhatásért döntően az álló fázis (ligandum) felelős, a HIC esetében az áramló fázis (eluens) a domináns tényező

38 Hidrofil kölcsönhatású folyadékkromatográfia
(Hidrophilic Interaction Liquid Chromatography; HILIC)

39 (A víz az erős oldószer !!!)
HILIC Állófázis: mint a normál fázisú kromatográfiában Eluens: mint a fordított fázisú kromatográfiában 3-40% vízzel (A víz az erős oldószer !!!) Alkalmazásai: RP-hez túl poláros, nehezen visszatartható komponensek elválasztására

40 Detektorok

41 A detektorok legfőbb jellemzői
Szelektív – univerzális Dinamikus tartomány Linearitási tartomány Érzékenység Destruktív – nem destruktív

42 Komponensek tulajdonságát észlelik
A folyadékkromatográfiás detektorok Komponensek tulajdonságát észlelik UV- látható abszorbancia detektor (UV- VIS) Fluoreszcenciás detektor (FLD) Elektrokémiai detektor (ECD) Radiokémiai detektor (RD) Tömeg detektorok (MSD) Előnyök: specifikusság, érzékenység, szelektivitás Hátrányok: minden vegyület más (pl. más UVmax)

43 Mozgófázis tulajdonságát észlelik
A folyadékkromatográfiás detektorok Mozgófázis tulajdonságát észlelik Törésmutató detektor (RID) Vezetőképesség detektor (CD) Fényszórásos detektor (LSD) Előnyök : nagyon sok komponensre – majdnem univerzális Hátrányok: zaj, érzékenység

44 Alapelv: Lambert-Beer törvény
UV-VIS detektor Alapelv: Lambert-Beer törvény

45 UV-VIS detektor Chromophore Amine Ethylene Ketone Ester Aldehyde
Carboxyl Nitro Phenyl Naphthyl - NH - C = C - C = O - COOR - CHO - COOH - NO 195 190 205 210 310 202, 255 220, 275 max(nm) 2 - Structure

46 UV-VIS detektor – UV spektrum
Abszorbancia (mAU) Benzamidofenol Paracetamol Kromatográfiás elválasztás; Minél magas hullámhossz annál szelektívebb  max pH függése oldószerek, adalékok UV elnyelése 280 nm 4 3 2 1 200 250 300 350 400 Hullámhossz (nm)

47 UV-VIS detektor – UV Cutoff
Solvent UV Cutoff (nm) Acetonitrile 190 UV cutoff is the wavelength at which absorbance equals 1, measured in a 1 cm cell with air as a reference. Water 190 Cyclohexane 195 Hexane 200 Methanol 210 Ethanol 210 Diethyl Ether 220 Dichloromethane 220 Chloroform 240 Carbon Tet 265 Tetrahydrofuran 280 (220) Toluene 285

48 VWD – Variable Wavelenght detector
lencse tükör Diffrakciós rács tükör deutérium lámpa A diffrakciós rács monokromatikus fényt állít elő tükör A monokromatikus fényt megosztjuk a referencia és minta fotodióda között Fénynyaláb osztó Átfolyó cella tükör Minta fotodióda Az intenzitásbeli különbséget a cellában történő abszorbancia okozza

49 Diódasoros detektor – DAD, Diodarray detector
Diode Array Grating Optical Slit Detector Flow Cell Homium Filter Achromatic Lens UV Lamp Vis Lamp

50 Deutérium lámpa tesztje

51 On-line spektrum Wavelength Time Absorbance Spectra

52 Csúcstisztaság Peak with time marker for spectra selection
Spectral differences at different points of peak elution Peak with time marker for spectra selection