Kapilláris elektroforézis

Az előadások a következő témára: "Kapilláris elektroforézis"— Előadás másolata:

1

2 Kapilláris elektroforézis

3 Definíciók Az elektroforézisnél az oszlop (réteg) két végére elektródokon keresztül feszültség van kapcsolva. Az oldatban lévő ionok a feszültség hatására elmozdulnak az ellentétes pólusú elektród felé. Az ionok töltésüktől és „méretüktől” függő sebességgel mozognak (migrálnak). Az elektroforézis alapjaiban nem kromatográfia, mert nincs megoszlás két fázis között. A minőségi jellemző a migrációs idő (tm) Mennyiségi jellemző a csúcsterület (A)

4 Ion sebesség és mobilitás
Az ionok sebessége arányos a feszültséggel.

5 Elektroforetikus mozgékonyság függése töltéstől és a súrlódástól

6 Kromatográfiás módok összehasonlítása

7 Különböző kölcsönhatási erők szerepe egyes kromatográfiás módokban
Ideális kromatográfiás Módok egyes anyagokra GC Könnyenilló, hőstabil vegyületek HPLC Poláros, nehezen illó, hőre bomló vegyületek EKC Ionos vegyületek A gázkromatográfia túlnyomórészt (70-95%) Forrpont szerinti szelektivitást mutat.

8 Klasszikus gél elektroforézis
A feszültség 1-2 kV. Magasabb feszültségnél az oldat felforr a Joule hő miatt. Analízisek több óráig tartanak.

9 Western blots módszer

10 Kapilláriselektroforézis készülék diagramja
Oszlop: kvarc, cm x 0,02-0,075 mm.

11 A teljes és az effektív oszlophossz

12 Agilent CE instrument

13 Kapilláris előnyei az elektroforézisben
Nagy hőleadás → nagyfeszültségesés → gyors analízisek → nagy hatékonyság U alakú áramlásprofil On-column detektálás Kevés puffer és minta szükséglet Csekély mintaelőkésztés igény az analízisek közötti gyors, hatékony oszlop regenerálás (0,1 N NaOH) miatt Egyszerű kezelés

14 A kapilláris kis átmérőjének előnye
A puffer tömegéhez képest nagy a kapilláris felülete, ezért intenzív a hőleadás. A nagy hőleadás megakadályozza azt, hogy a molekulák pufferben való áramlásakor keletkező súrlódási Joule hő felforralja a puffer. A nagy sebesség eléréséhez nagy feszültséget (30kV) lehet alkalmazni. A nagy sebesség gyors analíziseket eredményez. A nagy sebesség nagy hatékonyságot ( tp) biztosít

15 Nyomelemzések CE-vel A nagy hatékonyság lehetővé teszi több nagyságrenddel különböző csúcsok egymás melletti meghatározását.

16 CE csekély a mintaszükséglete
Mátrix komponensek két analízis között kimoshatók erős vegyszerekkel.

17 Gyors analízisek A rövid oszlophossz és a pufferben oldott reagens
teszi lehetővé a nagy sebességet.

18 Gyors analízisek Injektálás a rövidebb detektorhoz közeli végén
(fordított polaritás). Az elválasztás 15 cm úthosszon történik.

19 Az elektroozmotikus áramlás kialakulása (EOF) kvarc kapillárisban

20 A töltéssel elrendeződés és a zeta potenciál kvarc kapillárisnál
A kvarc kapilláris felületén lévő szilanol negatív töltéssel rendelkeznek pH 3 fölött.

21 Az EOF áramlás profilja
Az EOF áramlásprofilja laposabb mint a laminárisé, ezért a minta keskenyebb tartományba oszlik el, azaz nagyobb a hatékonysága.

22

23 EOF csökkentése és átfordulása pozitív töltésű detergenek hatására
Az EOF poliakrilamid vagy teflon borítással is megszüntethető.

24 Rendszerint az EOF nagyobb az ionok saját migrációs sebességénél
A nagysebességű EOF miatt az anionok is a katód felé áramlanak.

25 A tényleges és a látszólagos mozgékonyság

26 Az EOF egyenlete

27 Az EOF függése puffer koncentrációjától és az ionerősségtől

28 Az EOF függése a pH-tól és a függés hiszterézise
Az egyensúlyi szilanol koncentráció beállása időigényes folyamat. A gyakorlatban nem várják meg az egyensúly beálltát, hanem két analízis között lúggal mossák a kapillárist, ezért az EOF értéke reprodukálható.

29 A különböző kapilláris elektroforézises módszerek
Zonális Elektroforézis Izoelektromos fókuszálás Izotahoforézis.

30 A különböző kapilláris elektroforézises módszerek
Zonális elektroforézis: A különböző anyagok eltérő sebességgel haladnak töltésük és méretük szerint. Izoelektromos fokuszálás: A kapillárison pH gradiens van. Az ampholitok (pozitív és negatív töltéssel is rendelkezetnek) az izoelektromos (semleges) pontjuknak megfelelő helyen koncetrálódnak, és nem vándorolnak tovább. Kapilláris izotachoforézis: A vizsgált anyagok vezető és záró elektrolit között foglanak helyet vezetőképességűk sorrendjében, és egyforma sebességgel haladnak.

31 Zónás kapilláris elektroforézis

32 Zónás kapilláris elektroforézis
Az ionok sebessége függ A töltésüktől Töltésük polaritásától A méretüktől (hidrátburokkal együtt), alakjuktól A feszültségtől Az EOF-től A puffer viszkozitástól

33 Micelláris elektrokinetikus kromatográfia

34 Micelláris elektrokinetikus kromatográfia
A minta megoszlik a micellák és a háttér puffer között. A micellákba zárt minta migrációs sebessége eltér a háttér pufferben lévő molekulák sebességétől A töltéssel rendelkező micellákkal semleges molekulákat is el lehet választani

35 A kapilláris elektroforézis alkalmazásai

36