Molekuláris biológiai módszerek

Az előadások a következő témára: "Molekuláris biológiai módszerek"— Előadás másolata:

1 Molekuláris biológiai módszerek
Molekuláris biológiai módszerek Alapvető technikák

2 (tulajdonságok megváltoztatása)
Izolálás (tisztítás) Elválasztás Azonosítás Vizsgálat Manipuláció (tulajdonságok megváltoztatása) Ellenőrzés, mérés (kontrollok)

3 biológiai kísérlet mérés izolálás, tisztítás, elválasztás azonosítás,
élő minták kezelése ismeretlen hatású anyaggal kezelése ismert hatóanyaggal (pozitív kontroll) kezelés nélkül (negatív kontroll) biológiai kísérlet élettani hatások mérés manipuláció azonosítás, vizsgálat izolálás, tisztítás, elválasztás makro- molekulák

4 Biológiai anyagok elválasztása
Hajtóerők: Nyomás Elektromos erőtér Gravitációs erőtér Hajszálcsövesség

5 Szűrés, koncentrálás vírus partikulumok különböző makro- molekuák
szennyeződések

6 Dialízis A dialízis elmélete Dialízis-kazetták a zsákon belül
a zsákon kívül Dialízis Dialízis-kazetták

7 Centrifugálás Csapadék ülepítés Sejt(alkotó) ülepítés
Folyadékfázisok elválasztása Gradiens centrifugálás Kiegyensúlyozás

8 szögrotor kilendülőfejes rotor Rotortípusok

9 Sűrűséggradiens ultracentrifugálás
centrifugális erő cf. sűrűség- gradiens minta 40% 50% 60% 70% 80% A B Sűrűséggradiens ultracentrifugálás

10 Kromatográfia

11 Molekula jellege Elválasztás mechanizmusa Detektálás kizárásos
megoszlási adszorbciós ioncserés affinitás folyadék gáz elektroforézis nyomás hajszálcsövesség látható, UV, infra fluorescens radioaktív MS

12 Gélelektroforézis (méret, alak, töltés)

13

14

15

16 Agaróz + Agaropektin Agarobióz
D-galactose and 3,6-anhydro-L-galactopyranose

17

18

19

20 TAE, TBE, denaturáló

21

22

23

24

25

26

27 Pulzáló erőterű gélelektroforézis

28

29 Akrilamid

30

31 Poliakrilamid képződése
19:1 29:1 37,5:1

32 Poliakrilamid gél NATÍV, UREA, SDS-PAGE Protein, DNS (RNS) APS, TEMED
üveglapok spacerek tömörítő gél szeparáló gél SDS-poliakrilamid gél készítése APS, TEMED 5-20% pH, stacking dithiothreitol, β-mercaptoethanol, melegítés

33

34 Mozgékonyság = 1/lg molekulatömeg
Fehérje tisztaság, fehérjekomplexek, membránok és sejtalkotók fehérje-összetétele, Mutánsok, overexpresszió, stb.

35

36 ezüstfestés coomassie-festés radioaktivitás, WB

37 Western blot

38 2D elektroforézis Izoelektromos pont és nagyság szerint:
Fehérjék azonosítása Izoelektromos fókuszálás: Poliakrilamid v. agaróz géllemez, + amfoter elektrolitok (amfolitok), vagy rögzített pH gradiens

39

40

41 Kapilláris gélelektroforézis

42

43

44