Bioszeparációs technikák ELVÁLASZTÁSTECHNIKA

Az előadások a következő témára: "Bioszeparációs technikák ELVÁLASZTÁSTECHNIKA"— Előadás másolata:

1 Bioszeparációs technikák ELVÁLASZTÁSTECHNIKA
Mikrobiológiai szakképzés Zsigrainé dr. Vasanits Anikó

2 Tematika 1, Bevezetés, adszorpciós kromatográfia
2, Oszloptechnikák - Ion-, gél- és affinitás kromatográfia 3, Általános kromatográfiás fogalmak 4, Gázkromatográfia (GC) 5, Nagyhatékonyságú folyadékkromatográfia (HPLC) 6, Tömegspektrometria, kapcsolt technikák 7, Mintaelőkészítés, alkalmazások

3 MŰSZERES ANALITIKA Elektroanalitikai módszerek
Spektroszkópiai módszerek Elválasztástechnikai módszerek 70% kromatográfia, % gáz és 40-50% folyadék

4 Elválasztástechnika KROMATOGRÁFIA:
Speciális fizikai-kémiai, analitikai és preparatív elválasztási módszerek összessége, oldatban levő, szilárd, vagy gázhalmazállapotú, sokkomponensű elegyek összetevőinek egymástól való elkülönítésére. Általános alapelv: Egy keverék komponenseinek két egymással nem elegyedő fázis (álló- és mozgófázis) közötti anyagátmenet, valamint az egyes alkotóknak az álló- és mozgófázissal való eltérő kölcsönhatása.

5 Álló- és mozgófázis Állófázis: - szilárd,
- folyékony, de mindenképpen helyhez kötött. Mozgófázis: - gáz  gázkromatográfia - folyadék  folyadékkromatográfia - szuperkritikus folyadék  szuperkritikus fluid kromatográfia A fázisok közötti anyagátmenet dinamikus jellegű. Minta „útja”: mozgó fázis  állófázis  új mozgó fázis új állófázis

6 Kromatogram kialakulása
. A csúcskiszélesedés úgy is interpretálható, hogy adott anyagnak az oszlop elején egyszerre induló molekulái nem egyszerre érnek az oszlop végére, tehát nem mindegyik halad az adott molekulafajtára jellemző átlagsebességgel. A sebességnek (és így a tartózkodási időnek) a diszperziója a csúcskiszélesedés másik értelmezése.

7 Csúcs elúciós profil Ki = ci,s ci,m
This displacement causes the concentration of solute in the mobile phase at the front of the peak to exceed the equilibrium concentration with respect to that in the stationary phase. As a consequence, a net quantity of solute in the front part of the peak is continually entering the stationary phase from the mobile phase in an attempt to re-establish equilibrium. At the rear of the peak, the reverse occurs. As the concentration profile moves forward, the concentration of solute in the stationary phase at the rear of the peak is now in excess of the equilibrium concentration.

8 Dinamikus egyensúly jön létre
Dinamikus egyensúly jön létre. Időegység alatt az állófázisba bejutott molekulák (atomok, ionok) száma = időegység alatt a mozgó-fázisba jutott részecskék száma (egy másik pontján a rendszernek). Speciális kölcsönhatások a minta és az állófázis között: a, Fizikai - adszorpció, - abszorpció (megoszlás). b, Kémiai - másodlagos kötőerők, - sav-bázis és ionos kölcsönhatások. c, Biológiai - enzim-szubsztrát kapcsolat

9 A kromatográfiás módszerek csoportosítása
KÖLCSÖNHATÁS AFFINITÁS MÉRTÉKE Adszorpciós kromatográfia Adszorpció Adszorpciós együttható Megoszlási kromatográfia Megoszlás (extrakció) Megoszlási állandó Ioncserés kromatográfia Elektrosztatikus (megoszlás) Töltés, disszociációs állandó, ionátmérő Gélkromatográ-fia Diffúzió Molekulaméret Affinitás kromatográfia Biospecifikus (adszorpció) Nincs általános mérték (Michaelis állandó)

10 ADSZORPCIÓS KROMATOGRÁFIA
Elválasztás alapja: Egy bizonyos fázisban oldott keverék egyes összetevői a másik fázis határfelületén koncentráció különbségeket mutatnak. Eltérő adszorpciós koefficiensek → koncentráció különbség a fázishatáron. Elrendezés: szilárd adszorbens  folyékony-, vagy gáz mozgófázis (oszlopban, síklapon) Az összetevők eltérő adszorpciója az adszorbens részecskék felületén → a komponensek a mozgófázissal fokozatosan távoznak, eluálódnak.

11 Adszorpciós oszlopkromatográfia

12 Adszorbeált anyag és adszorbens közötti kölcsönhatás
Koordinatív kötés Másodlagos kötőerők (diszperziós, dipól-dipól és H-híd) DE! Kemiszorpció- kovalens kötés kialakulása kerülendő

13 Diszperziós+ dipolus-dipolus+ dipolus-indukált dipolus = Van der Waals erők

14 Adszorpciós egyensúly jellemzése az adszorpciós együtthatóval
KA ~ c állófázis c mozgófázis Izoterma telítési görbe Állófázison kialakul a monomolekuláris réteg→ c2 határértékhez közeledik Izoterma lineáris szakaszán lehet reprodukálhatóan mérni, ilyenkor az izoterma iránytangense a KA Ka függ az adszorbenstől, az eluenstől, hőmérséklettől. relatív borítottság: az elfoglalt aktív helyek számának és az összes aktív hely számának hányadosa adszorpciós izoterma: a relatív borítottság () az adszorbeálódó anyag parciális nyomásának függvényeként ábrázolva, állandó hőmérsékleten.

15 Adszorbensek jellemzése
Megfelelő szemcseméret. Szilárdság. Nagy felület (≥100 m2/g). Egyenletes pórusméret. Egyenletes szemcsealak, lehetőleg szabályos gömböcskék. Oldhatatlan legyen a mozgófázisban. Indifferens legyen a mozgófázissal és az elválasz-tandó vegyületekkel szemben.

16 Adszorbens aktivitása: kötőképesség erőssége.
Adszorbens kapacitása: egységnyi tömeg által adszorbeált anyagmennyiség. Adszorbens aktivitása: kötőképesség erőssége. Adszorbens szelektivitása: egységnyi adszorbenstömegen legnagyobb mértékben adszorbeált komponens mennyisége a többi összetevőhöz képest. Szervetlen adszorbensek: 1, Szilikagél – legáltalánosabban használt, Si-OH felületi csoportokkal, H-híd képzése az elválasztandó anyagokkal. Gyengén savas természetű – bázisos anyagok elválasztási nehézsége. pH=4-5 Kapacitás egyenesen arányos az adszorbens fajlagos felületével és a pórustérfogattal. Aktivitás az adszorbens kémiai sajátságaitól (oxid, oxid-hidrát, szerves polimer, stb.) és felületi sajátságaitól (szemcsenagyság, porozítás) függ.

17 O O O O

18 Terc butyl methyl ether = t BME

19 2, Aluminium-oxid – bázisos jellegű
Felületi Al-OH- és Al-O- -hoz kapcsolódó H-híd képzése. Szerves adszorbensek: 1, Aktívszén Növényi és állati eredetű anyagok elszenesítési terméke (fa-, dióhéj-, csont-, vér- és cukorszén). Apoláros adszorbens → nagy móltömegű, szerves vegyületek kötődnek nagyobb mértékben (aromás-, kén-, bróm-, és jódtartalmú molekulák) diszperziós kölcsönhatások révén.

20 A mozgófázis jellemezése
A minta összetevőit eltérő mértékben oldja. A minta összetevőivel és az állófázissal ne alakuljon ki irreverzibilis kölcsönhatás. Viszkozitása csekély legyen. ELUOTRÓP SOROK A mozgófázis elúciós készségét jellemezzük az alkalmazott rendszer függvényében (adszorbens és adszorbeált anyag). Az elúciós készség a dielektromos állandóval (ε) arányos. Sorrend: a, aluminium-oxidon (hidrofil adszorbens): hexán<<benzol<kloroform<<etil-acetát<acetonitril<etanol <metanol<víz<ecetsav b, aktívszén (hidrofób): fordított sorrend Oldószerelegyek használata. Tisztaság! Kicsi elucios készség→startól nem viszi el, széles és lapos sávokat ad, melyek egymást átfedik Nagy eluáló képességű→mindent egyszerre eluálnak és az oldószerfrontban tömörítenek. Aluminium-oxidon hexánban oldva viszik fel a mintát → keskeny startzóna képződik, elució nagyobb oldószer erősséggel.

21 Kromatográfia = színes írás
Mihail Cvet 1903 – növényi pigmentek elválasztása adszorpciós oszlopkromatográfiával. CaCO3 állófázis - petroléter /etanol mozgófázis. a mixture of C5–C6 hydrocarbons)

22 Kísérleti elrendezés Figure 2 shows the illustrations included in Tswett’s 1906 paper.6,10,11 His fairly simple laboratory setup consisted of 2–3 mm i.d. vertical columns, the upper parts of which were widened to serve as reservoirs for the solvent. The length of the packing was approximately 30–40 mm; a small cotton-wool wad was placed at the bottom to hold it in place. As many as five columns were connected to a manifold that comprised a horizontal glass tube connected to a larger vessel serving as a buffer volume. Using a small hand pump (a rubber bulb), he could exert a small pressure on the system. When separation was completed, the columns were removed, the adsorbent column — the packing with the separated multicoloured bands — was pushed out of the tube carefully with a wooden rod, and the individual bands were cut off with a scalpel. From these fractions, the adsorbed pure substances could be dissolved with a suitable solvent. If larger amounts were needed for additional investigations, columns of 10–30 mm i.d. with a packing length of 50–90 mm also were used. In such a situation, the separation process was performed under suction with a water-jet pump.

23

24 MEGOSZLÁSI KROMATOGRÁFIA
A folyadék-folyadékkromatográfiás elválasztás elvi alapja a megoszlás → oldódási egyensúly jön létre: Kd = c1 vegyület koncentrációja az állófázisban ↓ c2 vegyület koncentrációja a mozgófázisban Megoszlási állandó A folyékony állófázis rögzítése: Szilárd szemcséket folyadékban duzzasztják és oszlopba töltik. Állófázis típusai: 1, Szilikagél – poláros felület, apoláros mozgófázis, módosítok használata (pl. 1% víz). 2, Cellulózpor – használat előtt a szerves oldószerrel extra-hálni kell.

25 Állófázis: poláris Mozgófázis: apoláris (szerves oldószer)
Egymással ne elegyedjenek Egymásban kevéssé oldódjanak Advantages of NPLC: Large range in separation selectivity with  many solvents and modulators available to tune retention and selectivity Suitable for the separation of chemically closely related analytes, including isomers and diasteromers Can separate analytes that are soluble in apolar organic solvents  Suitable for the separation of chemical subclasses in sample pre-treatment techniques Reduced column backpressure due to use of low viscosity eluents More facile removal of volatile eluents in preparative HPLC  Drawbacks of NPLC: Predicting and maintaining eluent solvent strength more difficult compared to RPLC Longer column equilibrium times compared to RPLC if inorganic phases are used. Gradient elution not always straightforward, especially for bare inorganic phases Inorganic phases are sensitive to adsorption of contaminants (e.g. water) from the eluent Increased risk of evaporation and bubble formation due to low boiling points of solvents Financial consequences of purchase and disposal of organic eluents.

26 Belső kromatogram - rövidebb elválasztás, mivel az eluciót, csak a komponensek tölteten való elkülönítéséig végez-zük. Külső kromatogram – az eluciót addig végezzük, amíg az elválasztott komponensek el nem hagyják az oszlopot. Belső krom, kiértékelése zónák extrahálása, oldatok spektrofotometriásan, fluoreszcenciásan. Külső krom. Detektorok alkalmazása.

27 IONCSERÉS KROMATOGRÁFIA
Az ioncserélők olyan szerves vagy szervetlen anyagok, amelyek poláris funkciós csoportjaik réven képesek kationjaikat vagy anionjaikat az oldatban lévőkkel kicse-rélni. Az ioncserélők általá-ban szilárd halmazállapotú anyagok, de lehetnek vízben nem oldódó folyadékok is. Az ioncserélők funkciós cso-portjai lehetnek savak (katex - kationcserélő) vagy bázisok (anex – anioncserélő).

28 Ioncserélők típusai Ioncserélő gyanta - sztirol és divinil-benzol kopolimere Stabilak és nyomásállók. Gömb alakú részecskék (emulziós poli-merizáció). Aromás gyűrűre viszik fel kémiai reakcióval a megfelelő ioncserélő sajátságú funkcióscsoportokat. Szulfonálás, lsd előzö ábra

29 Ioncserélő gyanta - sztirol és divinil-benzol kopolimere

30 Dextránalapú ioncserélők
DEAE-Sephadex (dextránra kötött dietil-amino-etil). CM-Sephadex (karboxi-metil csoport). Stabilak. Vízben és szerves oldószerekben oldhatatlanok. Szilikagél alapú ioncserélők Módosított szilikagél, (3‹pH‹7). Szerves polimerrel fedett szilikagél (üveggyöngy). Az 1. és 3.b fázisok azok, amelyek nyomás alatt alkalmazhatók, így kis szemcseátmérőjű töltettel töltött kolonnákban használhatók, azaz nagy hatékonysággal üzemeltethetők. glükózegységekből 1,6-α-glükozid kötésekkel felépített lineáris poliszacharid, kevés oldallánccal. → Sephadex O-CH2CH2NH+(C2H5)2 DEAE O-CH2COO-

31 4. Aluminium-oxid alapú ioncserélők Amfoter jelleg!!!
Az alumínium-oxidnak az izoelektromos pontján mind anion, mind kationcserélő kapacitása van. Izoelektromos pontnak nevezzük azt a pH értéket, ahol a felületen lévő negatív és pozitív töltések száma megegyezik. Ennek az értéke viszont a használt puffertől függ, például citrát pufferben pI=3,5 karbonát pufferben pI=9,2. A hidrált alumínium-oxid anion és kationcserélő formája

32 Gyantához kötött funkciós csoportok
KATEX típusú: Rgyanta-SO3H erősen savas Rgyanta-COOH közepesen savas Rgyanta-OH gyengén savas ANEX típusú: Rgyanta-NR3OH erősen bázisos Rgyanta-NH3OH közepesen bázisos Rgyanta -SO3H szulfonsav Ioncserélő kapacitás: megkötött ellentétes töltésű ion mennyiség egységnyi tömegű tölteten (mmol/g vagy mekv./g).

33 Kationioncsere: Rgyanta-SO3H + Na+  Rgyanta-SO3Na + H+ Az oldatban lévő Na+ ionok a ioncserélő gyantára kötődnek, miközben ekvivalens mennyiségű H+ ionok kerülnek az oldatba. Eluensként híg, erős savakat használnak. Anioncsere: Rgyanta-N(CH3)3OH + Cl-  Rgyanta-N(CH3)3Cl + OH- Vagyis a gyantára kötött OH- ionok szabadulnak fel. Eluensként bázisos oldatokat használnak.

34 Anioncserélők - jellemzőjük, hogy az állófázis felületén rögzített pozitív töltések találhatók az elválasztás körülményei között. Kationcserélők - jellemzőjük, hogy az állófázis felületén rögzített negatív töltések találhatók az elválasztás körülményei között. Erős anioncserélők azok, amelyek ioncserélő kapacitása független az eluens pH értékétől. Ilyenek a kvaterner-ammó-nium vegyületek (pl. trimetil-ammónium, Type I). Ilyen típusú gyanták regenerálása nagy feleslegű bázist igényel , mivel ilyenkor OH-id formára kell hozni.

35 Gyenge anioncserélők, ezeknél a fázisoknál az ioncserélő kapacitása az eluens pH értékének függvénye. Ilyen csopor-tok a primer, a szekunder és tercier aminok. Ábra szekunder amin csoport protonálódási folyamata Ábra A gyenge anioncserélő kapacitásának függése a mozgó fázis pH értékétől . A teljes ioncserélő kapacitás értéke akkor érhető el, ha a mozgó fázis pH értéke az amino csoport pKb értékénél legalább 2 egységgel kisebb. (I. szakasz).

36 Gyenge kationcserélők állófázis szerkezete és kapacitás függése a mozgó fázis pH értékétől

37 Ionok kötödésének erőssége függ: Ionméret és fajlagos töltés.
Eluens jellemzőitől (víz, só, szerves oldószer elegye): puffer ion-koncentrációja, puffer pH-ja, alkalmazott szerves módosítok (metanol, etanol, glicerin, butanol, acetonitril), ellenion, mely a meghatározandó összetevővel verseng és ennek a folyamatnak az eredménye megszabja a visszatartást és a szelektivitást. puffer ion-koncentrációja nő – visszatartás csökkenEluenserősség Az előzőekből látható volt, hogy az eluenserősség egyrészt a mozgó fázisba tett puffer összetevő pH megszabta ionizáltságától függ, másrészt az ioncsere folyamatban a meghatározandó összetevő és puffer-ion verseng az ioncserélő helyen való kötődésért. Ha növeljük a puffer-ion koncentrációját ez csökkenti a minta összetevő megkötődési lehetőséget, így a visszatartását. Komplexképzésre való affinitás (hajlamosság) A mozgó fázis komplexképző sajátossága különösen fontos, ha több értékű fémionok elválasztását akarjuk megoldani. A többértékű fémionok erősen kötődnek a kation-cserélő felületén és ez nagy visszatartást eredményezne. Ezt csökkentjük az eluenshez adott komplexképzővel. Szerves oldószer hatása A visszatartás és a szelektivitás befolyásolására metanolt, etanolt, butanolt, glicerint és acetonitrilt kell adni a pufferhez. Ezek a szerves oldószerek adszorbeálódnak az álló fázis felületén. Mindazon ionok visszatartása és szelektivitása változni fog, amelyeknél a retenciót az álló fázis hidrofób részével történő kölcsönhatás befolyásolja. Például vízben oldódó szerves anionokét, ilyenek a formiát, acetát, propionát stb. Az ellenion minőségének és koncentrációjának hatása Az ioncsere egyensúlyi folyamat, amelyben a meghatározandó összetevő verseng a mozgó fázisban található ellenionnal ennek a folyamatnak az eredménye megszabja a visszatartást és a szelektivitást.

38 Anionok meghatározásakor többértékű gyenge savakat (pl
Anionok meghatározásakor többértékű gyenge savakat (pl. benzoesav, o-ftálsav, citromsav, borkősav) teszünk a mozgó fázisba, ezek ionos formái szolgáltatják az ellenionokat. , eluenserősség Ionizáltsági fok=eluenserősség Visszatartás alacsony pH-n nagy Az o-ftálsav ionizációjának és eluenserősségének függése a mozgó fázis pH értékétől

39 Kationok elválasztásakor többértékű gyenge bázisokat (pl
Kationok elválasztásakor többértékű gyenge bázisokat (pl. etilén-diamin, 2-metil-piridin) teszünk a mozgó fázisba, ezek ionos formái szolgáltatják az ellenionokat. A visszatartást megszabó folyamatok komplexképzőt és szerves bázist tartalmazó mozgó fázis alkalmazásakor

40 DETEKTÁLÁSI MÓDSZEREK
Az ionkromatográfiában fő detektálási módszer a mozgó fázis vezetésének figyelése, mérése. Az egykolonnás ionkro-matográfiában ez egy átfolyó mérőteres vezetőképességi cellát jelent. Meghatározások 95%-ában. 5 ppb – 5 ug/L kimutatási határ. Ion folyadékkromatográfiában csak néhány ionnak van az UV, vagy a látható fénytartományban fényelnyelése. Ezek például a jodid, nitrit, nitrát, jodát, kromát, permanganát. A kationok meghatározásánál használhatunk kolonna utáni (post column reaction) vagy kolonna előtti (precolumn reaction) származékképzést, s így színes komplexeket kapunk.

41 Ionelnyomás (szupresszió) hatása
Szupresszió előtt Vezetőképesség (mS) Szupresszió után Idő (min)

42 Két kolonnás ionkromatográfia

43 Ion elnyomás (supressed ion chromatography) ioncserekromatográfiánál – két kolonnás módszer cél: a mozgófázis vezetőképességének csökkentése a detektálás előtt Klorid ion mérése Az ionelnyomóban (erős kation cserélő oszlop H formában) lejátszódó folyamatok, ha az eluens puffere NaHCO3, vagy Na2CO3: Gyanta-SO3-H+ + Na+ → Gyanta-SO3-Na+ + H+ H+ + HCO3- → H2CO3 H+ +  Cl-  → HCl A mozgófázis vezetőképessége csökken (Na+ → H2CO3). Az elválasztott ion vezetőképessége megnő (NaCl → HCl). Az elválasztott ion vezetőképessége a Na ion (50 S*Cm2/equiv.) H ionnal (350 S*cm2/equiv.) történő cseréjével jelentősen megnő. Az ionelnyomó kolonnán a mozgó fázis kationjai akkor is lecserélődtek, ha mérés nem történt. Ennek következtében a kolonna ioncserélő kapacitása kimerült, így az elemzést le kellett állítani, és a kolonnát regenerálni kellett.

44 ELVÁLASZTÁSOK 1. Kationok elválasztása kationcserélő gyantaoszlopon
A proprietary ion exchange column, IonPacCS12, was used and the mobile phase consisted of a 20 nM methanesulphonic acid solution in water. A flow rate of 1 ml/min was employed and the sample volume was 25 ml. 1. Lithium 2. Sodium 3. Ammonium 4. Potassium 5. Magnesium 6. Calcium   Figure 57. Determination of Alkali and Alkaline Earth Cations The electrical conductivity detector has a sensitivity (minimum detectable concentration) of about 5 x 10-9 g/ml and a linear dynamic range of about 200 where 0.97 < r < It is used in probably over 95% of all analyses involving ion exchange procedures to separate inorganic and organic ions.  1=litium, 2=nátrium, 3=ammónium, 4=kálium, 5=magnézium, 6=kalcium

45 3. Vízlágyítás: Ca2+ és Mg2+ ionok Na+-ra cserélése.
2. Vízanalitikában a főbb ionok, különösen az anionok klorid, szulfát, stb. mérésére. !!!! 3. Vízlágyítás: Ca2+ és Mg2+ ionok Na+-ra cserélése. 4. Hidrofil szerves anyagok elválasztása

46 Vízanalitika, ásványvízek
Az ionkromatográfia közel negyed évszázados történetében az alkalmazások zöme a szervetlen anionok különböző összetett mintákban (mátrixokban) való meghatározására tevődött át. A környezetvédelmi analitika szempontjából ez azért fontos, mert amíg kationok egymás melletti meghatározása atomspektroszkópiai módszerrel (indukciós kapcsolású plazmaégő) megoldott, addig 1975-ig nem állt rendelkezésünkre olyan analitikai módszer, amellyel anionok egymás mellett 1 mg/dm3 koncentráció alatt egyszerre mérhetők lettek volna. a fluorid-ion 0,7-1,5 mg/dm3 között csont és fogzománc erősítő hatású, 1,5 mg/dm3 fölötti koncentrációban csont és fogzománc problémát okoz. A vizsgált minták között találtak 2,2 mg/dm3 fluorid-ion tartalmú ásványvizet. Ilyen ásványvizet gyerekek már nem fogyaszthatnak. A fenti példával azt kívántuk bemutatni, mennyire fontos, hogy megbízható analitikai módszerek álljanak rendelkezésünkre anionok és kationok egymás melletti meghatározására. A több összetevőt tartalmazó mintákban (összetett mátrixokban) az ionok meghatározására két módszer áll rendelkezésünkre: az ionkromatográfia és a kapilláris elektroforézis.

47 Automatikus aminosav analizátor
Erősen savas kationcserélő gyantán történik az amino-savak elválasztása. Az aminosavak kötődését nagyon sok tényező befolyásolja, alapvető szerepe a pH-nak és az ellenion koncentrációnak van. Alacsony pH-n az aminosavak kationként viselkednek. A pH növelésével egyre kevésbé, az izoelektromos pont elérésekor és magasabb pH-n egyáltalán nem kötődnek a gyantához.

48 Az aminosavakat erősen savas oldatban visszük fel az oszlopra, hogy a megkötődés azonnal bekövetkezzék. Az elúcióhoz pH 3-10 közötti pufferek széles skálája használa-tos. Az elúció leggyakrabban lépcsős gradiens elúció, azaz 3-4, fokozatosan növekvő pH-jú és ellenion koncentrációjú pufferrel történik az elválasztás. Az oszlopról távozó eluátumban az aminosavak mennyiségét általában ninhidrines színreakcióval határoz-zák meg. A fotometrálás átfolyó küvettás detektorban tör-ténik. Az aminosavak többsége (a primer aminok) a ninhidrinnel liláskék színreakciót ad ami 570 nm-en fotometrálható. A szekunder aminok (prolin, hidroxi-prolin) a ninhidrinnel sárga színű terméket képeznek, ami 440 nm-en mérhető. Az effluens és a ninhidrin-reagens keverékét az átfolyási sebesség által meghatározott ideig magas hőmérsékletnek teszik ki ( oC), így kialakul a szín, amelyet fotometrálnak.

49 Aminosavak reakciója ninhidrinnel

50 A total of 20 amino acids have even identified of which the animal can synthesise about half; these are called non-essential amino acids. However the others cannot be synthesised and must be provided in the diet. These are called essential amino acids. In the animal diet there are currently 4 main essential amino acids: lysine, methionine, threonine, and tryptophan. These amino acids are the most important nutritionally because limiting these will affect the growth and development of the animal. Supplemental amino acids can be added to feedstuff to increase efficiency of animal production and achieve a least cost feed formulation. Hydrolysis is required to determine the amino acid composition of feed proteins. During this process methionine is partially oxidised to methionine sulphoxide and methionine sulphone. This reaction occurs in a non reproducible way thus giving rise to quantitation errors. Cysteine is also partially oxidised to Cystine and Cysteic acid. In order to Rapid analysis of Sulphur Amino Acids Sulphur-containing amino acids (e.g. methionine and cystine) are considered the most critical limiting components of the feed proteins. Although methionine can meet the total need for sulphur amino acids in the absence of cystine, it cannot be synthesised from cystine, and therefore it is classified as essential. determine the sulphur amino acids accurately, the sample must be primarily oxidised with performic acid to quantitatively convert methionine and cyst(e)ine to methionine sulphone and cysteic acid, respectively.

51 GÉLKROMATOGRÁFIA Szinonim elnevezések:
gélszűrés, molekula-szűrés, méretkizárásos kromatográfia (SEC), géláthatolási kromatográfia (GPC). Egyike a legfontosabb biokémiai eljárásoknak. Elsősorban biológiai mak-romolekulák tisztítására alkalmazzák. 30 éve alkal-mazott technika. Fordított szűrő! Enzim, poliszacharid, nukleinsav, fehérje

52 Gélképző anyagok Természetes gélképző anyagok
Agaróz: D-galaktóz és 3,6-anhidro-L-galaktóz egységekből felépített lineáris poliszacharid. → Sepharose Félszintetikus gélképző anyagok Dextrán: glükózegységekből 1,6-α-glükozid kötésekkel felépített lineáris poliszacharid, kevés oldallánccal. → Sephadex A nyers dextrán részleges hidrolizsével nyert dextránfrakciók lúgos oldatához epiklórhidrint adnak. A keresztkötések számával csökken a gélek pórusmérete és annak a molekulaméretnek a határértéke, amely a gél szerkezetébe még éppen behatolhat. 1,2-,1,3-, 1,4-glükozid kötésekkel

53 Szintetikus gélképző anyagok
Akrilamid-akrilát kopolimerek: akrilamid és a N,N’-metilén-bisz-akrilamid kopolimerizációjával állítják elő. A pórusméretet elsősorban az akrilamid koncentrációja, másodsorban a keresztkötéseket létrehozó N,N’-metilén-bisz-akrilamid aránya határozza meg. Kereskedelmi forgalomban a Bio-Gel P típusok vannak. Előnyük, hogy a szemcsék ridegebbek, mechanikai hatásoknak ellenállóbbak, valamint a bakteriális hatások iránt közömbösek.

54

55

56 A GÉLKROMATOGRÁFIA ALKALMAZÁSI TERÜLETEI
Makromolekulák sómenetesítése Puffercsere Minta előkészítése pufferváltással ioncseréhez, vagy affinitás kromatográfiához. Reakciók lezárása makromolekulák és alacsony molekulatömegű reagensek között. Frakcionálás Hasonló molekulaméretű anyagok elválasztása → gél (megfelelő frakcionálási tartomány) helyes megválasz-tása elsődleges. Polimerek móltömeg eloszlása Molekulatömeg meghatározás – ismert tömegű fehérje standard oldatokkal kalibráció. 1-3: csoport leválasztás, melynél a molekulák mérete közötti különbség igen nagy

57 Makromolekulák sómenetesítése
Vezetőképesség (μS) A legalább két peptidkötést tartalmazó vegyületek lúgos (alkalikus) közegben a kék Cu2+ ionokkal (ezeket tartalmazza a Biuret-reagens) ibolyaszínű rézkomplexet képeznek, amelynek nm-nél abszorpciós maximuma van. A komplex fényelnyelési maximuma eltér a Cu2+ ionok fényelnyelési maximumától, így a komplex 570 nm-en történő fotometriás meghatározásából következtethetünk a jelenlevő fehérje mennyiségére. NaCl mérése ezüst-nitráttal, illetve konduktometriásan. A 570 nm

58 V0 = szemcsék közötti térfogat Vi = pórustérfogat
teljes kizárási M mérési tömeg lgM teljes áteresztési M Teljes kizárási és teljes áteresztési M jellemző egy adott gélre Vr= Vo+Vi V (ml)

59 glutamát dehidrogenáz (Mt = 290,000)
Frakcionálási példa Keverék: glutamát dehidrogenáz (Mt = 290,000) laktát dehidrogenáz (Mt = 140,000) szérum albumin (Mt = 67,000) ovalbumin (Mt = 43,000) cytochrome c (Mt = 12,400) Bio-Gel P-150 oszlopon mérési tömeg 15 kD – 150 kD glutamate dehydrogenase would elute first because it is above the upper fractionation limit. Therefore it is totally excluded from the inside of the porous stationary phase and would elute with the void volume (V0). Cytochrome c is below the lower fractionation limit and would be completely included, eluting last. The other proteins would be partially included and elute in order of decreasing molecular weight.

60 Polimerek elválasztása

61 AFFINITÁS KROMATOGRÁFIA
Az affinitás kromatográfia olyan típusú adszorpciós kromatográfiás eljárás, amelyben a tisztítandó anyag specifikusan és reverzibilisen adszorbeálódik a ligandhoz, amely egy oldhatatlan anyagon (mátrix) van rögzítve. 20 éve alkalmazott technika. Koncentráló hatású. Nagyfokú szelektivitás jellemzi. Immunaffinitás kromatográfiával az oszlopon megkötött antitestekkel (antibodies) antigéneket tisztítunk; Receptorok, enzimek, DNS fragmensek izolálására; Ellenanyaggal tisztíthatjuk azt a vegyületet, amely az ellenanyagot termelte; Immobilizált antitestekkel toxinokat kötnek meg vérből (hemoperfúzió); Szilárd fázisú immunoassay alkalmazásokban. Az ipar biotechnológiai alkalmazásokban monoklonális antitestek ipari méretekben történő gyártására.

62 ALKALMAZÁSA Anyagok tisztítására (enzim, antitest) komplex biológiai elegyekből. Ugyanazon anyag natív formájának elválasz-tására a denaturált anyagtól. Receptorok, enzimek, DNS fragmensek izolálása. Az ipari biotechnológiai alkalmazásokban monoklonális antitestek gyártása.

63 Mátrix tulajdonságai:
Oldhatatlan az alkalmazandó pufferekben és oldószerekben. Mechanikailag és kémiailag stabil, jó átfolyási tulajdonságokkal. Könnyen kapcsolható a ligandhoz. Ligand tulajdonságai: Specifikus és reverzibilis kötődési affinitással kell rendelkeznie a tisztítandó anyaghoz. Megfelelő kémiai csoportokkal kell rendelkeznie a mátrixhoz való kötödés érdekében.

64 Mátrix fajták Agaróz D-galaktóz és 3,6-anhidro-L-galaktóz egységekből felépített lineáris poliszacharid. → Sepharose (lsd. gélkromatográfia)

65 Poliakrilamid (lsd. gélkromatográfia)
A poliakrilamid-gyöngyök szintetikus akrilamid poli-merek, melyeket bisz-akrilamidos keresztkötésekkel megfelelően szilárd mátrixanyaggá alakítanak. Hátránya: - erősen tapad az üvegfelületekhez. Szabályozott pórusú üveg Legáltalánosabban alkalmazott szervetlen mátrix. Előnye: nagy mechanikai stabilitása. Használat: enzimek immobilizálása, melyeket biokata-lizátorként alkalmaznak a biotechnológiai folyama-tokban. Üvegeket szilikonozni kell használat előtt.

66 Aktivált agarózhoz (brom-ciánnal aktiválunk, ekkor az agaróz C- OH-ja C= NH-ra cserélődik) hozzáadjuk a primer aminocsoportot tartalmazó kapcsolót (R-NH2) (nem lehet túl hosszú a visszahajlás és hidrofób kölcsönhatások miatt, ami nem specifikus adszorbcióhoz vezet. A kapcsolókar aminocsoportját átalakítják karboxillá (borostyánkősav-anhidrid), majd karboimiddel kapcsolják hozzá a ligand szabad amin csoportját peptidkötés létesítésével.

67 Az affinitáskromatográfiás elválasztás lépései: 1, A tisztítandó anyag megkötése. Kialakuló kölcsönhatások: - elektrosztatikus; - hidrofób; - hidrogénhídkötések. Minta oldása megfelelő felvivő pufferben. 2, A nem kötődött anyagok kimosása (10 oszloptérfogat pufferrel). 3, Elució – kölcsönhatások megszüntetése 1, Szelektív elució: biospecifikus elució, melyben az eluálószer a, vetélkedik a liganddal a szelektíven kötött anyagért (leoldás) b, vetélkedik a megkötött anyaggal a ligandért (leszorítás)

68 a, Elution of NADP dependent enzymes from Blue Sepharose by adding NADPH
"polyHis tags" on recombinant proteins: a sequence of His residues is placed (by genetic engineering of a cloned gene) at the C-terminus of a specific recombinant protein to be produced in vivo, and that protein can be purified on a column with Ni2+ ions (or Cu2+ or Co2+ or Zn2+) held in chelated form on an affinity column; the His imidazole groups on the end of the recombinant protein bind with high affinity, but other proteins don't stick. The recombinant protein can then be eluted with an imidazole buffer. b, Elution of HIS tagged proteins from HiTrap Chelating by adding imidazole

69 2, Nem szelektív elució, sokszor denaturálódást jelent:
a, pH változtatása megvál-toztatja a töltéssel rendelkező csoportok ionizáltsági fokát a kötő helyeken → deszorpció b, ionerősség változtatása növekvő ionerősségű puffer használatával → ( pl. NaCl, 1 mólos végkoncentrációban).

70 Alkalmazás Fenil boronát affinitás kromatográfia - 1,2 és 1,3 cisz-diol csoportot tartalmazó cukrok kötődnek hozzá – borsav-komplexek Lúgos közegben stabil – savval, szorbittal megbontható

71 Fetuin elválasztása Fetuin is a serum glycoprotein widely distributed
in mammals. Bovine fetuin contains up to 30% carbohydrate and has a molecular mass of 48 KDa. Also of note is its ability to promote cellular growth. It is therefore often used in cell culture and might be considered a common impurity in manufacturing processes where serum is employed to support cell growth. Fetuin is also regularly used as a model protein to represent the properties of glycoproteins,

72 Ni-NTA gyanta His tagged proteinek tisztítására
NTA nitrilotriaceticacid