GTPáz aktivitás mérése gyakorlat Lévay Magdolna 2006.04.10.

Az előadások a következő témára: "GTPáz aktivitás mérése gyakorlat Lévay Magdolna 2006.04.10."— Előadás másolata:

1 GTPáz aktivitás mérése gyakorlat Lévay Magdolna 2006.04.10.

2 Módszer: GAP assay A kis GTPázok aktivitásának vizsgálata Rac GDP P Rac- GDP P P GAP

3 Módszer: GAP assay mosás Beütésszám pl. 82800 GAP nélkül: lassú GTP- hidrolízis GAP jelenlétében: gyors GTP- hidrolízis Beütésszám pl. 8468

4

5 Idő (min) Fehérjéhez kötött 32 P-GTP (%) A kis GTPázok aktivitásának vizsgálata I.: Időbeli kinetika -mérés egy GAP koncentráció mellett különböző időpontokban (pl. 0,5, 10, 15 perc)

6 A GAP relatív mennyisége kötött 32 P-GTP (%) A kis GTPázok aktivitásának vizsgálata II.: Koncentrációfüggés -mérés egy adott időpontban (pl. 5. perc)

7 Módszer: GAP assay A kis GTPázok aktivitásának vizsgálata P Rac- GDP GAP 2. Rac+ GAP Inkubálás → 100 μl oldat az indításhoz → 5 min inkubálás Rac- GDP P 3. A reakció leállítása → 150μl 4 o C Wash Buffer → nitrocelluóz korongra → mosás 5 ml Wash Bufferrel 1.b: GAP bemérése → Wash Buffer + GAP GAP Rac GDP P 1.a: Rac + [32P]GTP → inkubálás alacsony [Mg] mellett (10 min) → + 1μl 1 M MgCl 2 (10 min, 4 o C) → Assay buffer

8 Az oldatok összeállítása Rac töltése: 86μl nucleotide depletion buffer* 10μl 10 mg/ml BSA (bovine serum albumin) 1μl 10 mM ATP 1μl 10 mM DTT 1μl Rac (1-2 μg) 1μl [32P]GTP izotóp (25 μl= 10 MBq) +1μl 1M MgCl 2 Assay buffer: 100μl 10 mg/ml BSA 10μl 10 mM ATP 10μl 10 mM DTT 2-8 ml → 100 μl az indításhoz 10μl 10 mM GTP ad 1 ml Wash Buffer** 10 min inkubálás szobahőm. 10 min inkubálás 4 o C

9 Oldatok *nucleotide depletion buffer: 50 mM HEPES, pH 7.4 50 mM NaCl 0.1 mM DTT 0.1 mM EGTA 5mM EDTA **Wash Buffer: 25 mM HEPES, pH 7.5 50 mM NaCl 1 mM MgCl 2 10 ml 1 l

10 Beckman LS-5000TD Liquid SCINTILLATION COUNTER

11 A mérés alapja: Cerenkov effektus

12 Mire figyeljünk? Pipettázás

13

14 Mire figyeljünk? Pipettázás Vákuum legyen bekapcsolva!

15 Mire figyeljünk? Pipettázás Vákuum legyen bekapcsolva! Egy membránra egy mintát tegyünk

16 Mire figyeljünk? Pipettázás Vákuum legyen bekapcsolva! Egy membránra egy mintát tegyünk Membránok mosása

17 Mire figyeljünk? Pipettázás Vákuum legyen bekapcsolva! Egy membránra egy mintát tegyünk Membránok mosása Minták sorrendje, számozás

18 Mire figyeljünk? Pipettázás Vákuum legyen bekapcsolva! Egy membránra egy mintát tegyünk Membránok mosása Minták sorrendje, számozás Ne zavarjuk meg az izotóp laborban dolgozó munkatársunkat

19 Mire figyeljünk? Pipettázás Vákuum legyen bekapcsolva! Egy membránra egy mintát tegyünk Membránok mosása Minták sorrendje, számozás Ne zavarjuk meg az izotóp laborban dolgozó munkatársunkat Sugárvédelem!

20 Sugárvédelem Az izotópot mindig plexiüveg mögött nyissuk ki! Figyeljünk az izotópos hulladék elhelyezésére! Dokumentáció

21 Sugárvédelem Lehetőleg plexiüveg mögött és kesztyűben dolgozzunk.

22 Irodalom Settleman J, Albright CF, Foster LC, Weinberg Association between GTPase activators for Rho and Ras families. Nature. 1992 Sep 10;359(6391):153-4. Molnar G, Dagher MC, Geiszt M, Settleman J, Ligeti E. Role of prenylation in the interaction of Rho-family small GTPases with GTPase activating proteins. Biochemistry. 2001 Sep 4;40(35):10542-9. Ligeti E, Dagher MC, Hernandez SE, Koleske AJ, Settleman J. Phospholipids can switch the GTPase substrate preference of a GTPase-activating protein. J Biol Chem. 2004 Feb 13;279(7):5055-8. Epub 2003 Dec 29. Moskwa P, Paclet MH, Dagher MC, Ligeti Autoinhibition of p50 Rho GTPase-activating protein (GAP) is released by prenylated small GTPases. J Biol Chem. 2005 Feb 25;280(8):6716-20. Epub 2004 Dec 13.