ELVÁLASZTÁSTECHNIKA V.

Az előadások a következő témára: "ELVÁLASZTÁSTECHNIKA V."— Előadás másolata:

1 ELVÁLASZTÁSTECHNIKA V.
KROMATOFOKUSZÁLÁS KIRÁLIS, ZÁRVÁNY-KOMPLEX KROMATOGRÁFIA IMMOBILIZÁLT FÉMION AFFINITÁSI KROMATOGRÁFIA Dr. Kremmer Tibor EÖTVÖS LORÁND TUDOMÁNY EGYETEM Budapest

2 KROMATOFOKUSZÁLÁS CHROMATOFOCUSING

3 pH GRADIENS ELŐÁLLÍTÁSA
KROMATOFOKUSZÁLÁS SLUYTERMAN (1977) KROMATOGRÁFIÁS ELVÁLASZTÁS IZOELEKTROMOS PONT (pI) ALAPJÁN pH GRADIENS ELŐÁLLÍTÁSA IONCSERE ELVÉNEK FELHASZNÁLÁSA GÉLKROMATOGRÁFIA ELVÉNEK FELHASZNÁLÁSA

4 (pH, IONERŐSSÉG, KONCENTRÁCIÓ, POLARITÁS)
KROMATOFOKUSZÁLÁS GRADIENS KÉPZÉS (pH, IONERŐSSÉG, KONCENTRÁCIÓ, POLARITÁS) pH B > A A B V

5 KROMATOFOKUSZÁLÁS - pH-GRADIENS KÉPZÉS

6 A pH GRADIENS ALKALMAZÁSÁNAK MÓDJAI
KROMATOFOKUSZÁLÁS A pH GRADIENS ALKALMAZÁSÁNAK MÓDJAI IONCSERÉLŐ - GÉLKROMATOGRÁFIÁS TÖLTETBE VEZETETT pH GRADIENS IONOS (IONCSERÉLŐ) TÖLTETEN AMFOLITTAL KIALAKÍTOTT pH GRADIENS INERS HORDOZÓN (GÉLSZEMCSE) KOVALENS KÖTÉSSEL RÖGZÍTETT (IMMOBILIZÁLT) pH GRADIENS

7 KROMATOFOKUSZÁLÁS IONCSERÉLŐ – GÉLKROMATOGRÁFIÁS TÖLTETEN ELŐFELTÉTELEK AZ IONCSERÉLŐ AZ ELVÁLASZTÁS TELJES pH TARTOMÁNYÁBAN ÁLLANDÓ (POZITÍV VAGY NEGATÍV) TÖLTÉSŰ LEGYEN A FEHÉRJÉK BIZTOSAN KIZÁRÓDJANAK A GÉLSZEMCSÉK PÓRUSAIBÓL A pH GRADIENS OPTIMÁLIS SZAKASZA MEGFELELJEN A FEHÉRJÉK IZOELEKTROMOS PONTJÁNAK A FEHÉRJÉK IZOELEKTROMOS PONTJA AZ ELVÁLASZTÁS pH TARTOMÁNYÁNAK KÖZEPÉN LEGYEN

8 + + + + + + + pH pI (3X) 4 4,9 5 6 5,0 7 KROMATOFOKUSZÁLÁS - 1 + + + +
Áramlás iránya KROMATOFOKUSZÁLÁS - 1

9 + + + + + + + pH pI (3X) 4 5 4,9 6 7 5,0 KROMATOFOKUSZÁLÁS - 2 + + + +
Áramlás iránya KROMATOFOKUSZÁLÁS - 2

10 + + + + + + + pH pI 4 5 4,9 6 7 5,0 + + + KROMATOFOKUSZÁLÁS - 3
pH + + + + + 5,0 + + Áramlás iránya KROMATOFOKUSZÁLÁS - 3

11 + + + + + + + pH pI 4 4,9 5 6 5,0 7 - - - KROMATOFOKUSZÁLÁS - 4
+ 5,0 + + Áramlás iránya KROMATOFOKUSZÁLÁS - 4

12 + + + + + + + pH pI 4 4,9 5 6 5,0 7 KROMATOFOKUSZÁLÁS - 5   
+    5,0 + + Áramlás iránya KROMATOFOKUSZÁLÁS - 5

13 + + + + + + + pH pI 4,9 4 5 5,0 6 7 - - - KROMATOFOKUSZÁLÁS - 6
+ + Áramlás iránya KROMATOFOKUSZÁLÁS - 6

14 + + + + + + + pH pI 4,9 4 5 6 5,0 7 - - - KROMATOFOKUSZÁLÁS - 7
+ 5,0 + - - - + Áramlás iránya KROMATOFOKUSZÁLÁS - 7

15 KROMATOFOKUSZÁLÁS IONCSERÉLŐ – GÉLKROMATOGRÁFIÁS TÖLTETEN
ELŐFELTÉTELEK A FEHÉRJE IZOELEKTROMOS PONTJA AZ ELVÁLASZTÁS pH TARTOMÁNYÁNAK KÖZEPÉN LEGYEN AZ IONCSERÉLŐ AZ ELVÁLASZTÁS TELJES pH TARTOMÁNYÁBAN ÁLLANDÓ (POZITÍV VAGY NEGATÍV) TÖLTÉSŰ LEGYEN A FEHÉRJE BIZTOSAN KIZÁRÓDJON A GÉLSZEMCSÉK PÓRUSAIBÓL A pH GRADIENS OPTIMÁLIS SZAKASZA MEGFELELJEN A FEHÉRJE IZOELEKTROMOS PONTJÁNAK

16 KROMATOFOKUSZÁLÁS IONCSERÉLŐN AMFOLITTAL
MULTIFUNKCIÓS ANIONCSERÉLŐ OSZLOP EGYENSÚLYBA HOZVA pH = 7 PUFFERREL ELÚCIÓ (MINTA FELVITEL) MEGFELELŐ pI - TARTOMÁNYÚ AMFOLITOT (AMFOTER POLIELEKTROLIT) TARTALMAZÓ pH = 4,2 PUFFERREL AZ ELUCIÓ SORÁN AZ AMFOLIT MEGTITRÁLJA AZ IONCSERÉLŐT ÉS pH-GRADIENST HOZ LÉTRE, AMELYBEN A FEHÉRJE MOLEKULÁK pI ÉRTÉKÜKNEK MEGFELELŐEN KÖTÖDNEK ÉS KÜLÖNBÖZŐ RETENCIÓVAL OLDÓDNAK LE

17 REFERENCIA FEHÉRJÉK ELVÁLASZTÁSA KROMATOFOKUSZÁLÁSSAL
(Cytochrom C – Ribonuclease – Lentil-lectin)

18 L – Aminosav oxidáz izoenzimek elválasztása
kromatofokuszálással Mono P oszlopon

19 KROMATOFOKUSZÁLÁSSAL
HAEMOGLOBIN VARIÁNSOK ELVÁLASZTÁSA KROMATOFOKUSZÁLÁSSAL

20 IZOM FEHÉRJÉK ELVÁLASZTÁSA KROMATOFOKUSZÁLÁSSAL

21 TOJÁS FEHÉRJÉK ELVÁLASZTÁSA KROMATOFOKUSZÁLÁSSAL

22 KIRÁLIS ZÁRVÁNY - KOMPLEX KROMATOGRÁFIA

23 A KIRALITÁS ELVE Glicerinaldehid Enantiomerek

24 ENANTIOMEREK ELVÁLASZTÁSA KIRÁLIS (ZÁRVÁNY - KOMPLEX) KROMATOGRÁFIÁVAL
KÖZVETETT MÓDSZEREK SZÁRMAZÉK KÉPZÉS KOVALENS KÖTÉSSEL, KIRÁLIS VEGYÜLETTEL ELVÁLASZTÁS NORMÁL, VAGY FORDÍTOTT FÁZISON FIZIKAI-KÉMIAI TULAJDONSÁGOK ELTÉRÉSE ALAPJÁN Pl MARFEY – REAGENS (1-FLUORO-2,4 DINITROFENIL 5 L-ALANIN ELŐNYÖK KÖVETELMÉNYEK REAKCIÓ SEBESSÉG NEM BEFOLYÁSOL, KROMATOGRÁFIA KÖRÜLMÉNYEIVEL JÓL OPTIMÁLHATÓ, SZELEKTIVITÁS, DETEKTÁLÁS NÖVELHETŐ, MINTA ELŐTISZTÍTHATÓ, ANTIPÓDOK KÜLÖN ALKALMAZHATÓK REAGENS OPTIKAI TISZTASÁGA, KROMOFOR CSOPORT IGÉNYE, MINDKÉT ANTIPÓD KELL, REPRODUKÁLHATÓ-KVANTITATÍV REAKCIÓ, STABIL, EGYSÉGES SZÁRMAZÉK-TERMÉK

25 KÖZVETLEN MÓDSZEREK ENANTIOMEREK ELVÁLASZTÁSA
KIRÁLIS (ZÁRVÁNY - KOMPLEX) KROMATOGRÁFIÁVAL KÖZVETLEN MÓDSZEREK KIRÁLIS ADALÉKANYAGOK ALKALMAZÁSA CIKLODEXTRINEK - KORONAÉTEREK KOMPLEX - IONPÁR KÉPZŐK EGYÉB LIGANDUMOK AZ ÁRAMLÓ FÁZISBAN (dinamikus módszerek) AZ ÁLLÓ FÁZISON KÖTVE – KIRÁLIS ÁLLÓ FÁZISOK (sztatikus módszerek)

26 KIRÁLIS (ZÁRVÁNY - KOMPLEX) KROMATOGRÁFIA AZ ÁRAMLÓ FÁZISBAN
KIRÁLIS ADALÉKANYAGOK ALKALMAZÁSA AZ ÁRAMLÓ FÁZISBAN ZÁRVÁNY KOMPLEX KÉPZŐK CIKLODEXTRIN SZÁRMAZÉKOK, KORONA ÉTEREK TERNER KOMPLEXEK (FÉMION – KIS LIGANDUM - ENANTIOMER) DIASZTEREOMER – IONPÁR KÉPZŐ KOMPLEXEK AZ ÁLLÓ FÁZIS FÁZIS FELÜLETÉN KIRÁLIS ELLENIONNAL (KÁMFOR SZULFONSAV, KININ-KINIDIN, PIRROLIDIN KARBONSAVAK)

27 AZ ÁLLÓ FÁZISBAN KIRÁLIS ÁLLÓ FÁZISOK
KIRÁLIS (ZÁRVÁNY - KOMPLEX) KROMATOGRÁFIA KIRÁLIS ADALÉKANYAGOK ALKALMAZÁSA AZ ÁLLÓ FÁZISBAN KIRÁLIS ÁLLÓ FÁZISOK ZÁRVÁNY KOMPLEX KÉPZŐK (KOVALENSEN KÖTÖTT CIKLODEXTRIN SZÁRMAZÉKOK, KORONAÉTEREK) PIRKLE-TIPUSÚ FÁZISOK (3,5-DINITRO-BENZIL l-AMINOSAV) CELLULÓZ ALAPÚ FÁZISOK (ACETÁT, KARBAMÁT, IZOTIOCIANÁT,BENZOÁT ÉSZTEREK) MAKROCIKLUSOS GLIKOPEPTIDEK (VANCOMYCIN) FORDÍTOTT (REVERSED) AFFINITÁSI KROMATOGRÁFIÁS FÁZISOK - MAKROMOLEKULÁRIS KÖTÖTT LIGANDUMOK (ALBUMIN, AGP, OVOMUKOID, AVIDIN, KIMOTRIPSZIN, STB.) LIGANDUM CSERE ELVÉN ALAPULÓ FÁZISOK

28 KORONA ÉTEREK CIKLODEXTRINEK
ZÁRVÁNY-KOMPLEX KÉPZŐK A KIRÁLIS KROMATOGRÁFIÁBAN KORONA ÉTEREK CIKLODEXTRINEK

29 A KIRÁLIS KÖLCSÖNHATÁSOK 3 PONTOS SZABÁLYA
A KIRÁLIS KÖLCSÖNHATÁSOK TIPUSAI DIPOL – DIPOL  -  (SAV-BÁZIS) H – DONOR, AKCEPTOR TÉRIGÉNY GÁTLÁS ZÁRVÁNY KÉPZŐDÉS KOMPLEX KÉPZÉS, LIGANDUM CSERE, KIRÁLIS KÖRNYEZET (HELIX) AROMÁS GYŰRŰ HATÁSOK, MEREV MOLEKULA SZERKEZET

30 CIKLODEXTRINEK (CD) -CD β-CD -CD Molekula összetétel C36H60O30
n (glukóz egység) 6 7 8 Molekula tömeg (g/mol) 972.86 I297.15 Specifikus optikai rotáció (g/mol) 150.5 162. 5 177.4 Oldékonyság vizben (súly %, 25OC) 14.50 1.85 23.20 Üregátmérő (Å) 4.7 6.0 7.5 Üregtérfogat (A3) 174 262 427 Üregtérfogat /g (ml) 0.10 0.14 0.20 Víz ekvalens az üregben 11 17 pK3 a hidroxil csoportokra 12.33 12.20 12.08 Zárvány vegyület Benzol Naftalin Antracén

31 A CIKLODEXTRINEK SZERKEZETE

32 A CIKLODEXTRINEK MOLEKULA SZERKEZETE

33 GABA-RECEPTOR SPECIFIKUS ANALOG VEGYÜLET
(rac-NSC 382) enantiomerek (R, S) elválasztása CELLULÓZ-p-METIL BENZOESAV ÉSZTER OSZLOPON (CHIRALCEL OJ, DAICEL) MolnárT, Visy J et al. Bioorg. Med. Chem. Lett. (2008)

34 Oxazepam enantiomerek (R, S) királis elválasztása BSA-HPLC oszlopon
Fitos, I., Visy, J., Simonyi, M. and Hermansson, J. (1995). Separation of enantiomers of benzodiazepines on the Chiral-AGP column. J. Chromatogr. A, 709, Oxazepam enantiomerek (R, S) királis elválasztása BSA-HPLC oszlopon (0,01M foszfát puffer, pH: 7,0 2% ACN) Fitos I, Visy J, Simonyi M. J. Biochem. Biophys. Methods (2002) rac-NCS 382

35 rac-Oxazepam és rac-oxazepam hemiszukcinát enantiomerek elválasztása
Chiral-AGP oszlopon (0,01M foszfát puffer, pH:7, % ACN) Fitos I, Visy J. et al. J Chromatogr. (1995) rac-NCS 382

36 KÜLÖNBÖZŐ HIDANTOIN ÉS BARBITURÁT SZÁRMAZÉKOK KIRÁLIS ELVÁLASZTÁSA ChiraSep DN BP6 OSZLOPON (HEXÁN-2-PrOH-ACN)

37 AFFINITÁSI KROMATOGRÁFIA IMMOBILIZED METAL ION AFFINITY CHROMATOGRAPHY
IMMOBILIZÁLT FÉM ION (KELÁT - KOMPLEX) AFFINITÁSI KROMATOGRÁFIA IMAC IMMOBILIZED METAL ION AFFINITY CHROMATOGRAPHY

38 IMMOBILIZÁLT FÉM ION (KELÁT-KOMPLEX) AFFINITÁSI KROMATOGRÁFIA
IMAC

39 HUMÁN SZÉRUM AGP IMAC VIZSGÁLATA

40