A gének és betegségek kapcsolata Molnár Mária Judit A gének és betegségek kapcsolata Molnár Mária Judit

Klinikai Genetika – Genomikai Medicina A gének és betegségek kapcsolata Molekuláris biológiai metodikák Onkogenetika (solid tumorok, onkohaematológia) Kromoszóma rendellenességek, veleszületett rendellenességek és dysmorphiás syndromák Monogénes betegségek klinikai manifesztációja Neurogenetikai betegségek Belgyógyászati betegségek Haematológiai betegségek Cardiológiai betegségek Szemészeti betegségek Bőrgyógyászati betegségek Polygénes, multifaktoriális betegségek genetikája Személyre szabott orvoslás Közvetlenül a fogyasztók által rendelhető genetikai vizsgálatok A genetikai betegségek megelőzése: szűrés, genetikai tanácsadás A genetikai betegségek kezelési lehetőségei A genetikai orvoslás etikai és jogi aspektusai

1953 4

Év Nobel-díjasok Felfedezés 1953 F. Crick, J. Watson, M. Wilkins DNS molekula szerkezete 1965 F.Jacob, J. Monod, A. Lwoff Genetikai szabályozás 1966 P. Rous Onkogén vírusok 1968 R. Holley, G. Khorana, M. Nireberg A genetikai kód megfejtése 1975 D. Baltimore, R. Dulbecco, H. Temin Interakció a tumor vírusok és a nuclearis DNS között 1978 W. Arber, D. Nathans, H. Smith Restrictios endonuclease 1980 B. Benacerraf, J. Dausset, G. Snell Immunológiai válaszok genetikai kontrollja 1983 B. McClintock Mobil gének (transposonok) 1985 M. Brown, J. Goldstein Sejt receptorok familiáris hypercholesterinaemiában 1987 S. Tonegawa Antitestek genetikai aspektusa 1989 M. Bishop, H. Varmus Onkogének tanulmányozása 1993 R. Roberts, P. Sharp ‘Split gének’ 1995 E. Lewis, C. Nüsslein-Volhard, E. Wieschaus Homeostasis és egyéb fejlődéstani gének 1997 S. Prusiner Prionok 1999 G. Blobel Fehérje transzport signaling 2000 A. Carlsson, P. Greengard, E. Kandel Signal transductio az idegrendszerben 2001 L. Hartwell, T. Hunt, P. Nurse Sejtciklus regulátorok 2002 S. Brenner, R. Horritz, J. Sulston Genetikai szabályozás a fejlkődésben és programozott sejtahalál (apoptosis) 2006 A. Fire, C. Mello RNS interferencia

Mi a genomika ? biológiai összhangzattana DNS szintű variációk és a gén expressziós mintázatok összességének bioinformatikailag értékelt biológiai összhangzattana

„systems biology”= rendszer-szemléletű biológia Genom-Alapú Biológia „systems biology”= rendszer-szemléletű biológia NFkB genomikai adatbázisok „high-throughput” technológiák bioinformatika

Humán Genom Program 1990-2003

“Welcome to the Genomic Era” Guttmacher and Collins, NEJM 2003;349:996 DNA 50th Anniversary Human Genome Sequence “DNA Changed the World: Now What?” NY Times, February 25, 2003

Három „törvény” The amount of available DNA sequence data will double every 18 months The number of available genomes will double every 18 months The cost of sequence will drop by a factor of 2 every 18 months.

A modern biológia fejlődése populációk (Darwin) egyedek (Mendel) tervezett élőlények sejtek (szintetikus biológia) kromoszómák modellek (rendszerbiológia) egyedi gének, fehérjék, molekulák egyszerre sok gén, molekula (molekuláris biológia) (genomika, proteomika, stb.) 1850 1900 1950 2050 2000 Pósfai György ábrája

A DNS-ben lévő információtömeg hatalmas (22 + 1) pár kromoszóma 3.2 milliárd nukleotid bázis ~26.000 gén (genom 1.4%) 2 m DNS 1014 sejt– 5.9 fénynap

Egy gén DNS szekvenciájának megváltozása megváltoztathatja a kódolt fehérjét 13

Az emberi sokféleség genetikai alapja Frequency Example Rules for assigning allele to class Class of variation 5,692,700 (~93%) A/T Single base substitution involving A,T,C, or G Single Nucleotide Polymorphism (SNP) 431,319 (~7%) T/-CCTA/G Designated using the full sequence of the insertion as one allele, and either a fully defined string for the variant allele or a “-” character to specify the deleted allele. Deletion/Insertion Polymorphisms (DIPs) 2,440 (0.04%) gatagatagatagata Alleles are designated by providing the repeat motif and the copy number for each allele. Microsatellite or short tandem repeat (STR) 1,859 (0.03%) (alu) / - Applies to insertion/deletion polymorphisms of longer sequence features, such as retroposon dimorphism for Alu or line elements. Named variant Derived from dbSNP release 119 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/

Hosszuk 2-50 bp és introni régióban vannak. Az STR olyan mintázat, ahol 2 vagy több nt ismétlődik és az ismétlődő sequenciák közvetlenül egymás mellett vannak Hosszuk 2-50 bp és introni régióban vannak. STR polymorphismus azt jelenti, amikor a homolog STR locusok repeat száma az egyedek között különbözik. Egy adott elhelyezkedésű adott sequencia a genomben meghatározza az egyén genetikai profilját.

Combined DNA Index System (CODIS) DNA database funded by the FBI 1 aatttttgta ttttttttag agacggggtt tcaccatgtt ggtcaggctg actatggagt 61 tattttaagg ttaatatata taaagggtat gatagaacac ttgtcatagt ttagaacgaa 121 ctaacgatag atagatagat agatagatag atagatagat agatagatag atagacagat 181 tgatagtttt tttttatctc actaaatagt ctatagtaaa catttaatta ccaatatttg 241 gtgcaattct gtcaatgagg ataaatgtgg aatcgttata attcttaaga atatatattc 301 cctctgagtt tttgatacct cagattttaa

Transposon- jumping gene Class I – Retrotransposon 2 lépésben iródik át: 1. DNSből RNS transcriptióval, majd RNS ből DNS reverse transcriptióval. Ezt követően a DNS kópia az genomban új helyre ékelődik be. Class II - DNS transposon Itt az RNS nem iktatódik közbe, tarnsposonase katalizál. „Cut and paste”- a retrovirus ezzel a módszerrel integrálódik. A transposonok mutagének Ha funkcionális génbe insertálódik tönkreteszi annak a funkcióját - Ha elhagyja a gént a fennmaradó „lukat” nem tudja javitani a sejt - Alu elementek gátolják a mitosis and meiosis alatt a chromosomák párosodását így egyenőtlen crossovert eredményeznek és ez okozza leggyakrabban a chromosomák duplikációját.

A kis 7SL cytoplasmikus RNS-ből származik Az Alu elemek a DNS erősen repetitiv szekvenciái CpG szigetekben gazdagak, max 300 bp hosszúak, melyek a human genom legmobilisabb elemei (transposon). Tartalmaz funkcionális RNS polymerase III promotert, intermedier nem-codoló elementeket, és RNS-szerű poly(A) farkat. A kis 7SL cytoplasmikus RNS-ből származik Az Alu inserciókat több human betegséggel és rosszindulatú daganattal is kapcsolatba hozták. Pl. ha kódoló régióba insertálódik: neurofibromatosis, haemophilia, agammaglobulinaemia, leukemia, emlőrák, ovárium tu alakulhat ki

Centralis dogma: egy gén, egy protein

A DNS-től a Proteomig Genom Mi történhetne? Transcriptom Mi történhet? Proteom Mi történik

A génszabályozás ma ismert epigenetikai tényezői Methylation Phosphorylation P Acetylation Ac Ac Ac Ac Me Ub MicroRNA Histone proteins Ac Ac Me Ub AAA Ub SUMO Ub Ubiquination Sumoylation

Lehetséges epigenetikus hatással rendelkező viselkedéses és társas tényezők Szülői magatartás Krónikus stressz Életmód Metiláció = gyengítés Acetiláció= erősítés

Mi történik a „rossz” patkányanya kölykeivel? Glukokortikoid receptor gén („fő stresszreceptor”) metilációja a stresszre adott válasz egyik központi meghatározója stresszelhetőség nő 1,2 ERα ösztrogénreceptor metilációja nőihormon receptor, mely az anyai viselkedést is meghatározza fogamzóképesség és anyai magatartás csökken IV BDNF metilációja általános regeneráló és öregedést gátló vegyület gyengébb ellenállóképesség, rosszabb hangulat, gyorsabb öregedés 1Weaver et al (2004). Nat Neurosci 7(8): 847-54 2Szyf et al (2005). Front Neuroendocrinol 26(3-4): 139-42 3,4Champagne et al (2003, 2006) Physioll Behav, 79(3), 359–371. Biol Psychiat, 59(12), 1227–1235 5Roth et al (2009). Biol Psychiat, 65(9), 760–769.

98.7% -a az emberi genomnak nem kódol fehérjét („junk”?!?) 98%

A főbb genom technológiák DNS Sequencia Sequencia változások Kópiaszám változás SNP variációk Messenger RNS (gén expresszió) Micro RNS Protein-DNS kötődés (transcription factor binding) Specifikus proteinek szintje (mass. Spec) Protein conformatiós változások (mass. Spec) Protein-protein interactiok (mass. Spec/2-hybrid) Protein elhylezkedés Genetikai interakciók

GÉNHÁLÓZATOK- ÚTVONAL ANALÍZIS METODIKAI REPERTOIRE TELJES GENOM VIZSGÁLAT FEHÉRJE FIZIKAI TECHNIKÁK Biofizika, nanofizika GCAATCGATCTGGTACAGTAGCTA GCAATTGATCGGGTACATTAGCTA Hap-Map/ 20 millió pontmutáció ADATBÁZISOK BIOINFORMATIKA GÉNHÁLÓZATOK- ÚTVONAL ANALÍZIS EXPRESSZIÓS MICROARRAY/CHIP NANOTECHNOLÓGIA, Szilárd Fázisú KÉMIA NYELVÉSZET ELJÁRÁSOK

SNP

Genotyping Hybridization based methods Enzyme based methods Eg. SNP microarrays Enzyme based methods RFLP PCR based methods Other postamplification methods based on the physical properties of the DNA SSCP DHPLC

Illumina SNP Tipizálás Single Nucleotide Polymorphisms 1 every ~1200 bp (~5M/person) > 6,200,000 validated SNPs Genomic DNA [ T/C ] ‘T’ Allele Primer A G ‘C’ Allele Primer 23&Me 399 USD 1.000.000 SNP meghatározását kínálja

Whole Human Genom Microarray Kit Microarray metodika Amplifikáció és jelölés Mintából RNS izolálás RNS minőség ellenőrzése Az összes (44.000) gén expressziójának kumulált ábrázolása Hibridizáció Bioinformatikai kiértékelés A mRNS tisztítása gyári kit-el történik, majd a tisztaság és az integritás ellenőrzése után a mRNS-t amplifikáljuk és egy-szín (Cy-5, fluoreszcensz) jelölést alkalmazunk. A hibridizáció az Agilent 4x 44 ezer emberi génpróbát tartalmazó lemezén történik a gyári előírásnak megfelelően. A leolvasás után az adatok normalizálása, majd bioinformatikai értékelése történik. A középső blokkban az összes gén expresszióját kumulálva mutatjuk. AGILENT Adatnormalizálás Feature Extraction Scannelés Whole Human Genom Microarray Kit 4x44K – G4112F

Array Comparative Genomic Hybridization (aCGH) Delivering decisions from DNA to investigate genomic imbalance at a much higher resolution than is possible by traditional metaphase cytogenetic techniques (FISH)

1 2 5 4 3 Reference sample Test sample DNA isolation Microarray image Deletion Deletion Deletion Deletion Deletion Reference sample Test sample DNA isolation 1 Microarray image DNA DNA DNA labelling 2 Bioinformatical analysis Bioinformatical analysis Bioinformatical analysis 5 Hybridization to microarray slides Scanning 4 3

Sanger sequencing Chain termination method The key principle of the Sanger method was the use of dideoxynucleotide triphosphates (ddNTPs) as DNA chain terminators

Next Generation Sequencing High Throughput Techniques Lynx Pyrosequencing Illumina Solid Etc. Allele frequency determination in pooled samples derived from amplicon resequencing with Illumina

Orvosi Genomika Milyen gének vesznek részt a kóros fenotípus kialakításában A genom hogyan befolyásolja az egyes betegségekre való hajlamot a gyógyszer reaktivitást és mellékhatást – farmakogenomika Hogyan befolyásolhatjuk a genom működését: génterápia Mi a genom-környezet kölcsönhatásának szerepe a betegségek kialakulásában - epigenetika

Molekuláris genetikai diagnosztika Infektológiai diagnosztika (pl. HPV) Genetikai azonosítás apaság, igazságyügyi orvostan Genetikai diagnosztika Somatikus átrendeződés tumorokban Tumorokban megváltozó génexpressziók Genetikai rizikótényezők Farmakogenomika Monogénes beteségek

“Except for being hit by a car when crossing the street, all human disease is genetic.” Reed Pyeritz, MD Newsweek, 1981

Monogénes vs Complex Betegségek

Monogénes Betegségek: Sikertörténet

Heritabilitás A genetikai faktorok milyen arányban vesznek részt a betegség kialakításában Huntington-kór Schizophrenia gének környezet Rheumatoid Arthritis Hyperlipidaemia 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100 %

Genetic diseases Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM) A catalog of human genes and genetic disorders http://www.blc.arizona.edu/courses/181gh/rick/human_genetics/jpegs/cells.jpg

Komplex fenotípusok Mit várhatunk? gén 1 gén 1 gén 2 gén 5 gén 2 környezet gén 3 gén 4 környezet Kevés gén a környezeti faktorokkal együtt magas rizikót okozhat Sok gén a környezeti faktorokkal együtt alacsonyabb rizikóval jár

Complex polygénes betegségek génjeinek azonosítása nagy kihívás A gén variánsok hatása kicsi (gyenge genotypus-phenotypus asszociáció) A környezet, a diéta, az életstílus befolyásolja a betegségek génjeinek expresszióját – epigenetika A GWAS vizsgálatok leginkább a gyakori és nem a ritka variánsokat vizsgálták Nagy populációk szükségesek, ahhoz hogy a GWAS vizsgálatoknak statisztikai ereje legyen A klinikai vizsgálatokban sokszor rossz volt a vizsgálati terv, a populáció struktúrája, az etnikai összeállítása (az SNPk frequenciája az egyes etnikai csoportokban különböző) Sok kezdeti asszociáció nem reprodukálódott a későbbi vizsgálatokban  a klinikai validálás hibája

A genetikai rendellenességek típusai A nukleáris genom rendellenessége (23 pár kromoszóma, 3 milliárd bázis, 22-25 ezer gén) Kromoszóma-rendellenességek Monogénes betegségek Oligo- és poligénes betegségek Epigenetikai módosulások Mitokondriális genom rendellenessége (17 ezer bázis, 37 gén) 44

Öröklődésmódok Mendeli öröklődés (AD, AR, XR, XD, Y) Multiplex allélek, komplex öröklődés- vércsoport Uniparentalis disomia (meiosis hiba) pl. Angelman sy. Genomialis imprinting 80 imprinted humán gén (pl Prader Willi sy.) Mitochondrialis öröklődés

Genetikai ok: a 15q11-q13 deléciója Epigenetika Angelman szindróma Súlyos mentális retardáció, ataxia, „vidám” megjelenés, epilepszia Prader-Willi szindróma Mentális retardáció, obesitas, hypogonadismus Genetikai ok: a 15q11-q13 deléciója Anyai kromoszóma deléció (UBE3A gén) Apai kromoszóma deléció Ubiquitin-protein ligase E3A methilációs probléma – sex specifikus imprinting.

Mitochondriális öröklődés A mitochondriális DNS: 17.000 bázis, 37 gén: 13 protein (légzési lánc), 22 tRNS, 2 rRNS. De: a mitochondriális fehérjék száma ~1500. Döntő részüket a nukleáris genom kódolja! A petesejt 100.000 – 1.000.000 kópia mitokondriális DNS-t tartalmaz (polyplasmia).

Minden mitochondriumnak saját DNS-e van 500-2000 mitochondrium/sejt Minden mitochondriumnak saját DNS-e van Az mtDNS kis, kerek, polyplasmikus, maternálisan öröklődik Nincs repair rendszere A mitochondrion is a structure formed by two membranes separated by a space, the outer and the inner membrane, which forms these foldings called the cristae. The space enclosed by the inner membrane is the matrix, which appears moderately dense. In the matrix you find strands of DNA, ribosomes or small granules. A mitochondrion can be 1-10 m big and are present in the cytoplasm of all eukaryote cells of animals and higher plants an also in some microorganisms such as fungi.

Mitochondrialis medicina mtDNS sequencia Mitochondrialis medicina Diagnostika mtDNS betegségek Populáció genetika Antropologiai marker

Az mtDNS populációgenetikai jelentősége Maternalis öröklődés, nincs recombináció mtDNS variációk = haplotypusok (a D-loop alapján 27 haplotypus) Filogeographia

Human mtDNS morbiditási térképe 51

Genetikai tesztek Biokémiai genetika Cytogenetika Molekuláris genetika 52

Biokémiai genetika Metabolitok: pl. hosszú szénláncú zsírsavak gázkromatográfiája Fehérje szerkezet: pl. dystrophin Western blot dystrophinopathiak esetében Enzimaktivitás: pl. foszforiláz aktivitás McArdle betegség, alpha glucosidase Pompe kór 53

Cytogenetika (kromoszóma rendellenességek detektálása) Klasszikus kromoszóma analízis: karyotipus Kromoszoma átrendeződések vizsgálata: speciális festési technikák Mikrodeléció szindróma, duplikációk detektálása: pl. FISH 54

Monogénes betegségek mutációs profiljai Átrendeződések Pontmutációk Nukleotid repeat expansiok 55

Gén átrendeződés Átrendeződések Deléció Intragénikus (in frame, out of frame) pl. Duchenne MD, HNPP Nem egy génhez köthető (sokféle hatás) pl. FSH Duplikáció pl. CMT1a (PMP22) Átrendeződések detektálása Southern blot Real Time PCR MLPA Quantitativ fluorescens fragment hossz elemzés 56

Deléció típusok eat the big mac – vad típus In frame deléció eat the mac– in frame deléció Out of frame deléció eat the big mac eah ebi gma – out of frame deléció 57

Pontmutációk – nem synonym egyes nukleotid polymorphizmusok Nonsense Missense Splice site mutáció Pontmutáció detektálása PCR – RFLP, Real-Time PCR Szekvencia analízis 58

Nukleotid repeatek Ismétlődő szekvenciák (CAG, CGG, GAA, CTG, CCTG, ATTCT) a genomban Ismétlődő egységek: 3, 4, 5 nukleotid 59

Trinukleotid repeat betegségek I. típus II. típus Betegség Huntigton kór, SCA, FRAXA, dystrophia myotonica, Friedreich ataxia Ismétlődő egység CAG CGG, CTG, GAA Instabilitás foka közepesen stabil nem stabil Repeat lefordítódik-e proteinre igen nem Patológia speciális neuronok károsodása multiszisztémás betegségek Patomechanizmus toxikus proteinek hatása hypermetiláció, transkipciós interferencia, toxikus mRNS 60

Charting a course for genomic medicine from base pairs to bedside Green ED and Guyer MS: Nature 2011; 470, 204–213

A genetikai markerek szerepe a betegellátásban