Strukturális genomika Gyakorlati feladatok. SNP-k és vizsgálatuk Mi az SNP?

Az előadások a következő témára: "Strukturális genomika Gyakorlati feladatok. SNP-k és vizsgálatuk Mi az SNP?"— Előadás másolata:

1 Strukturális genomika Gyakorlati feladatok

2 SNP-k és vizsgálatuk Mi az SNP?

3 SNP-k és vizsgálatuk Mi az SNP? Egypontos nukleotid polimorfizmus

4 SNP-k és vizsgálatuk Mi az SNP? Egypontos nukleotid polimorfizmus Milyen gyakori egy- egy SNP?

5 SNP-k és vizsgálatuk Mi az SNP? Egypontos nukleotid polimorfizmus Milyen gyakori egy- egy SNP? Több, mint 1%

6 SNP-k és vizsgálatuk Mi az SNP? Egypontos nukleotid polimorfizmus Milyen gyakori egy- egy SNP? Több, mint 1% Hogyan lehet azonosítani?

7 SNP-k és vizsgálatuk Mi az SNP? Egypontos nukleotid polimorfizmus Milyen gyakori egy- egy SNP? Több, mint 1% Hogyan lehet azonosítani? ASA (AS-PCR)

8 SNP-k és vizsgálatuk Mi az SNP? Egypontos nukleotid polimorfizmus Milyen gyakori egy- egy SNP? Több, mint 1% Hogyan lehet azonosítani? ASA (AS-PCR) DNS szekvenálás

9 Allél specifikus amplifikáció - ASA (wt) ◦CGT AGT CCT TGA AGC TAT ……………… TAT GTA CGT AGC TGA (m) ◦CGT AGT CCT TGA AGC TAC ……………… TAT GTA CGT AGC TGA

10 Allél specifikus amplifikáció - ASA (wt) ◦CGT AGT CCT TGA AGC TA T ……………… TAT GTA CGT AGC TGA (m) ◦CGT AGT CCT TGA AGC TA C ……………… TAT GTA CGT AGC TGA

11 Allél specifikus amplifikáció - ASA (wt) ◦CGT AGT CCT TGA AGC TA T ……………… TAT GTA CGT AGC TGA (m) ◦CGT AGT CCT TGA AGC TA C ……………… TAT GTA CGT AGC TGA Tervezzünk primerpárt!

12 Allél specifikus amplifikáció - ASA (wt) ◦5’ CGT AGT CCT TGA AGC TA T ……………… TAT GTA CGT AGC TGA 3’ ◦3’ GCA TCA GGA ACT TCG ATA.…………….. ATA CAT GCA TCG ACT 5’ (m) ◦5’ CGT AGT CCT TGA AGC TA C ……………… TAT GTA CGT AGC TGA 3’ ◦3’ GCA TCA GGA ACT TCG ATG.…………….. ATA CAT GCA TCG ACT 5’ Hány primerre lesz szükségünk?

13 Allél specifikus amplifikáció - ASA (wt) ◦5’ CGT AGT CCT TGA AGC TA T ……………… TAT GTA CGT AGC TGA 3’ ◦3’ GCA TCA GGA ACT TCG ATA.…………….. ATA CAT GCA TCG ACT 5’ (m) ◦5’ CGT AGT CCT TGA AGC TA C ……………… TAT GTA CGT AGC TGA 3’ ◦3’ GCA TCA GGA ACT TCG ATG.…………….. ATA CAT GCA TCG ACT 5’ Hány primerre lesz szükségünk? 3

14 Allél specifikus amplifikáció - ASA (wt) ◦5’ CGT AGT CCT TGA AGC TA T ……………… TAT GTA CGT AGC TGA 3 ’ ◦3’ GCA TCA GGA ACT TCG ATA.…………….. ATA CAT GCA TCG ACT 5 ’ (m) ◦5’ CGT AGT CCT TGA AGC TA C ………… TAT GTA CGT AGC TGA 3’ ◦3’ GCA TCA GGA ACT TCG ATG.………… ATA CAT GCA TCG ACT 5 ’

15 Allél specifikus amplifikáció - ASA (wt) ◦5’ CGT AGT CCT TGA AGC TA T ……………… TAT GTA CGT AGC TGA 3 ’ ◦3’ GCA TCA GGA ACT TCG ATA.…………….. ATA CAT GCA TCG ACT 5 ’ (m) ◦5’ CGT AGT CCT TGA AGC TA C ………… TAT GTA CGT AGC TGA 3’ ◦3’ GCA TCA GGA ACT TCG ATG.………… ATA CAT GCA TCG ACT 5 ’

16 Primer tervezés programmal FAST PCR Ellenőrzés: MultAlin ◦www.multalin.toulouse.inra.fr/multalin/multalin.htmlwww.multalin.toulouse.inra.fr/multalin/multalin.html Reverz primer ellenőrzéséhez ◦www.bioinformatics.org/SMS/rev_comp.htmlwww.bioinformatics.org/SMS/rev_comp.html

17 Emésztés RE-vel (wt) CGT AAT GAA TTC AGT TGC EcoRI akcióban

18 SNP van az RE helyen (m) CGT AAT GAA CTC AGT TGC EcoRI akcióban

19 Emésztés RE-vel (m) CGT AAT GAA CTC AGT TGC EcoRI akcióban

20 Gélelektroforézis

21 Gélelektroforézis m wt

22 ESE Mutáció az MLH1 gén 3. exon 5’ végén az ESE-ben Exon 1 Exon 2 Exon 3

23 ESE Mutáció az MLH1 gén 3. exon 5’ végén az ESE-ben Mi történik az RNS érés során? És mi történne, ha nem lenne mutáció? Exon 1 Exon 2 Exon 3

24 ESE Mutáció az MLH1 gén 3. exon 5’ végén az ESE-ben Exon 1 Exon 2 Exon 3 Exon 1 Exon 2 Exon 3

25 Kromoszóma séta PCR-ral 5 tagú DNS könyvtár (mi a DNS könyvtár?) Állítsuk sorba a tagjait (mi a módszer alapja?) ◦AGT TGA ………GCT CGT GAA ◦GTA CGT AGT ….CGT TGC CGT ◦GTG AAT…..CGT AGT ◦TAG TAG CTT…..CTG TAC GTA ◦CGT ATG ….TGA AGT

26 1 23456 2.: ligálás plazmid vektorba 1.: emésztés restrikciós endonukleázzal 1 2 53 4 6 1 2 5 3 4 6 Genomkönyvtár készítés

27 3.: transzformáció Escherichia coli-ba 3 1 2 4 5 6 3 1 2 4 5 6 2.: ligálás plazmid vektorba

28 Sanger-módszer Milyen sorrend olvasható le a gélfotóról? Melyik DNS band melyik szekvenciával azonosítható? n A C G T 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 GGCCA GGCCATCGTTGA GGC GGCC GGCCATC GGCCATCG GGCCATCGTTG GGCCAT GGCCATCGT GGCCATCGTT

29 Sanger-módszer Milyen sorrend olvasható le a gélfotóról? Melyik DNS band melyik szekvenciával azonosítható? n A C G T 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 GGCCA GGCCATCGTTGA GGC GGCC GGCCATC GGCCATCG GGCCATCGTTG GGCCAT GGCCATCGT GGCCATCGTT A3’ G T T G C T A C C5’

30 Sanger-módszer A leolvasott szekvencia alapján mi a templát DNS bázissorrendje? n A C G T A3’ G T T G C T A C C5’ 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1

31 A leolvasott szekvencia alapján mi a templát DNS bázissorrendje? GGTAGCAACT Sanger-módszer n A C G T A3’ G T T G C T A C C5’ 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1

32 Piroszekvenálás A pirogram alapján milyen sorrendben követték egymást a nukleotidok? Mi a templát DNS bázissorrendje?

33 Piroszekvenálás A pirogram alapján milyen sorrendben követték egymást a nukleotidok? G C T A Mi a templát DNS bázissorrendje?

34 Piroszekvenálás A pirogram alapján milyen sorrendben követték egymást a nukleotidok? G C T A Mi a templát DNS bázissorrendje? CGTCCGGA

35 KRAS gén analízis piroszekvenálással KRAS onkogén 12p12 RAS család tagja, GTPáz 21kD-s fehérjét kódol (p21ras, vagy K-Ras) K-Ras funkció: molekuláris kapcsoló ◦intracelluláris jelutak szabályozása ◦pl: EGFR közvetítette jelátvitel során „downstream” jelátviteli affektor.

36 KRAS gén analízis piroszekvenálással A KRAS gén BIOMARKER Jelzi, hogy hogyan fognak reagálni a betegek a kezelésre Szabályozza egyes fehérjék működését befolyásolja a sejt túlélését, a daganat érképzését, az áttétképződési folyamatot.

37 KRAS gén analízis piroszekvenálással

38 Mutáció a KRAS génben -> folyamatosan aktív K-Ras protein -> szabályozatlan sejtosztódás -> számos rák alapja Leggyakoribb mutációk:12., 13., 61. kodon

39 KRAS gén analízis piroszekvenálással

40

41