ELVÁLASZTÁSTECHNIKAI MÓDSZEREK ELMÉLETE ÉS GYAKORLATA V. Dr. Kremmer Tibor V. FOLYADÉKKROMATOGRÁFIÁS MÓDSZEREK IONCSERÉLŐ FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA EÖTVÖS LORÁND TUDOMÁNY EGYETEM Budapest – 2013

TÖRTÉNETI ÁTTEKINTÉS Ószövetség (Exodus xv. 23-5) víz tisztítás Arisztotelész (cit. Hellferich, 1959) tengervíz sótlanítás Bacon (XVII. sz. eleje) alkimia, gyógyszerészet, derítés-perkolálás Thompson (1850), Way (1852) kationok adszorpciója agyagon Eichorn (1858), Boedecker (1859) egyensúlyi folyamatokra empirikus egyenletek Harms (1896) cukorgyártásban szabadalom Harms és Rümpler (1903) szervetlen szintetikus ioncserélők Gans (1905) Al-szilikátok alkalmazása vízlágyításra Fischer és Hoffmeister (1910-20) Kuhn, Lederer és Winterstein (1932-35) fehérje kémiai alkalmazások, tisztítás elválasztás Adams és Holmes (1935- ) polimerkémia, szerves ioncserélők, PDB műgyanták, bakelit (hanglemez !) Moore és Stein (1945) aminosav analizis - készülék

Ion Exchange Chromatography IONCSERÉLŐ FOLYADÉK KROMATOGRÁFIA Ion Exchange Chromatography (IEX) WAX – SAX (weak – strong) WCX - SCX

IONCSERÉLŐ FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA AZ ELVÁLASZTANDÓ ANYAG(OK) ÖSSZETEVŐK IONOS, vagy IONIZÁLHATÓ TULAJDONSÁGA FUNKCIONÁLIS CSOPORTOK TÖLTÉSE ÉS MINŐSÉGE IZOELEKTROMOS PONT (makromolekula, biopolimer) A TÖLTÉS VISZONYOK (net charge) VÁLTOZÁSA A pH ÉS IONERŐSSÉG HATÁSÁRA MOLEKULA TÖMEG ÉS SZERKEZET DETEKTÁLHATÓSÁG BIOLÓGIAI AKTIVITÁS OLDÉKONYSÁG STABILITÁS

FEHÉRJE MOLEKULA SZERKEZETÉNEK IONOS, VAGY IONIZÁLHATÓ FUNKCIONÁLIS CSOPORTJAI

IONCSERÉLŐ FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA AZ ÁLLÓ FÁZIS – IONCSERÉLŐ TÖLTETEK TENTACLES KATION CSERÉLŐK GYENGE - ERŐS ANION CSERÉLŐK ~~N+H2 < ~~N+HR < ~~N+R2 < ~~N+R3 erősen szubsztituens (R) függő

ERŐS - GYENGE IONCSERÉLŐ TÖLTETEK IONCSERÉLŐ FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA KATION CSERÉLŐK Negatív töltésű funkcionális csoportokkal (szulfonil, karbonil, CM, PO4) ANION CSERÉLŐK Pozitív töltésű (primer, vagy szubsztituált, szekunder, tercier, kvaterner amino, imino, guanidil, stb.) funkcionális csoportokkal AMFOTER (kevert) TIPUSOK Pozitív és negatív töltésű funkcionális csoportokat tartalmazó komplex szerkezettel IONCSERÉLŐK ERŐS - GYENGE DISSZOCIÁCIÓ FOKA (pKA, pKK, pKI) SZERINT „TENTACLE” ELV - KAPACITÁS !

IONCSERÉLŐ KROMATOGRÁFIÁS TÖLTETEK Elnevezés Összetétel (matrix) Gyártó - Forgalmazó Dowex A (WBA) C 88 Sztirol divinil benzol SIGMA Amberlit IR SERVA Sepharose Q, DEAE, ANX, SP, CM, Dextrán-agaróz kopolimer Pharmacia-LKB BioBeads MonoQ MonoP, MonoS Polivinil sztirol kopolimer Fractogel EMD DEAE 650 TMAE 650 SO3- 650 Poli metilmetakrilát Merck, Darmstadt AG MP, 50W, X4 Akrilát Poliamin BioRad Laboratories

KÉMHATÁS - pH - PUFFEREK IONCSERÉLŐ FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA AZ ÁRAMLÓ FÁZIS A LEGFONTOSABB MODULÁLÓ TÉNYEZŐK KÉMHATÁS - pH - PUFFEREK AZ IONCSERE EGYENSÚLYI FÁZISÁBAN A MEGFELELŐ ELLENION ÉS AZ IONCSERÉLŐ TÖLTÉSÉNEK BIZTOSÍTÁSA AZ ELVÁLASZTANDÓ ANYAG(OK) TÖLTÉSÉNEK KIALAKÍTÁSA (pozitív, vagy negatív, pl. fehérjék) AZ IONCSERE pH-val MODULÁLT ELÚCIÓS FÁZISÁBAN AZ ELVÁLASZTANDÓ VEGYÜLETEK ÉS AZ IONCSERÉLŐ IONOS KÖLCSÖNHATÁSAINAK SZELEKTÍV MEGVÁLTOZTATÁSA

A kationcserélő kromatográfiában használt pufferek pKa pH tartomány Foszfát 2,12 7,21 12,32 1,1-3,1 6,7-7,6 11,8-12 Citrát 3,06 4,74 6,40 2,4-3,4 3,7-5,7 4,4-6,4 Formiát 3,75 3,8-4,3 Szukcinát 4,20 4,3-4,8 Acetát 4,75 4,8-5,2 N-Metil piperazin 4,5-5,0 Malonát 5,69 5,0-6,0 2-(N-morfolino)etán szulfonsav (MES) 6,15 5,5-6,7 N-(2-acetamido) iminodiecetsav (ADA) 6,62 5,8-6,9 Piperazin-1,4 bis (2-etán szulfonsav) (PIPES) 6,80 5,9-7,1 (1,3-Bis tris-(hidroximetil) metilamino propán (Bis-tris-propán) 6,4-7,3 3-(N-morfolino) propánszulfonsav (MOPS) 7,20 6,5-7,5 HEPES 7,55 7,6-8,2 Borát 9,35 8,2-10,2 Glicilglicin 3,14 8,25

Az anioncserélő kromatográfiában használt pufferek (klorid, ill Az anioncserélő kromatográfiában használt pufferek (klorid, ill. K-Na só) Puffer pKa pH tartomány Bis tris-(hidroximetilamino) metán 6,50 5,8-6,4 (1,3-Bis tris-(hidroximetil) metilamino propán (Bis-tris-propán) 6,80 6,4-7,3 Trietanolamin 7,80 7,3-7,7 Tris-hidroximetilamino metán 8,16 7,6-8,0 N-Metil dietanolamin 8,54 8,0-8,5 Dietanolamin 8,90 8,4-8,8 1,3 Diaminopropán 10,47 8,5-9,0 9,8-10,3 Etanolamin 9,50 9,0-9,5 2-(Ciklohexilamino) etánszulfonsav (CHES) 8,9-10,2 3-(Ciklohexilamino) propánszulfonsav (CAPS) 10,40 9,7-10,6 Foszfát 12,3 11,08-12,0

IONERŐSSÉG (I) - IONMINŐSÉG IONCSERÉLŐ FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA AZ ÁRAMLÓ FÁZIS IONERŐSSÉG (I) - IONMINŐSÉG összefüggésből számítható, ahol: ci az i-edik ion koncentrációja, zi2 az i-edik ion töltés számának négyzete.

POLARITÁS METANOL, ACETONITRIL IONCSERÉLŐ FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA AZ ÁRAMLÓ FÁZIS POLARITÁS AZ ÁRAMLÓ FÁZIS POLARITÁSÁNAK VÁLTOZTATÁSA (CSÖKKENTÉSE) ADALÉK OLDÓSZEREKKEL METANOL, ACETONITRIL AZ IONOS KÖLCSÖNHATÁSOK ERŐSSÉGÉNEK VÁLTOZTATÁSA

IONCSERÉLŐ FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA MUNKAFOLYAMATAI

EGYENSÚLYI ÁLLAPOT BEÁLLÍTÁSA KEMOSZORPCIÓ IONCSERÉLŐ FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA EGYENSÚLYI ÁLLAPOT BEÁLLÍTÁSA (EKVILIBRÁLÁS) AZ ELVÁLASZTANDÓ ANYAGOK KÖTŐDÉSÉRE AZ EGYÉB (KONTAMINÁNS) ANYAGOK ELKÜLÖNÍTÉSÉRE A MEGFELELŐ ÁLLÓ FÁZIS KIVÁLASZTÁSA AZ ÁRAMLÓ FÁZIS PARAMÉTEREINEK OPTIMÁLÁSA pH, IONERŐSSÉG-MINŐSÉG, POLARITÁS KEMOSZORPCIÓ AZ ÁRAMLÓ FÁZISBAN OLDOTT MINTA KÖLCSÖNHATÁSBA HOZÁSA AZ ÁLLÓ FÁZISSAL AZ EGYÉB (NEM KÖTŐDŐ) ANYAGOK LEOLDÁSA AZ ÁRAMLÓ FÁZISSAL (ELÚCIÓ)

GRADIENS ELUCIÓ AZ ELUENS PARAMÉTEREINEK VÁLTOZTATÁSA IONCSERÉLŐ FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA A DESZORPCIÓ MŰVELETEI (ELVÁLASZTÁS, FRAKCIONÁLÁS) AZ IONOS KÖLCSÖNHATÁSOK SZELEKTÍV MEGBONTÁSA AZ ÁRAMLÓ FÁZIS PARAMÉTEREINEK pH, IONERŐSSÉG, POLARITÁS SZISZTEMATIKUS SZAKASZOS és/vagy FOLYAMATOS, EGYIDEJŰ vagy KÜLÖNÁLLÓ VÁLTOZTATÁSÁVAL IZOKRATIKUS ELUCIÓ GRADIENS ELUCIÓ AZ ELUENS PARAMÉTEREINEK VÁLTOZTATÁSA SZAKASZOS - LÉPCSŐZETES LINEÁRIS, vagy EGYÉB (KONVEX, KONKÁV, stb.) FÜGGVÉNYKAPCSOLAT SZERINT

B > A A B pH V GRADIENS KÉPZÉS IONCSERÉLŐ FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA (pH, IONERŐSSÉG, KONCENTRÁCIÓ, POLARITÁS) pH B > A A B V

A GRADIENS ELÚCIÓ ÉS FÜGGVÉNYKAPCSOLATAI pH Jel (AU) V0 (t0) Elúciós térfogat (idő) A B C D A GRADIENS ELÚCIÓ ÉS FÜGGVÉNYKAPCSOLATAI

Példa a gradiens elúció hatására

IONCSERÉLŐ KROMATOGRÁFIÁS ELVÁLASZTÁSA 21 TERMÉSZETES AMINOSAV IONCSERÉLŐ KROMATOGRÁFIÁS ELVÁLASZTÁSA Dionex DC-6A ANIONCSERÉLŐ OSZLOPON (30X0,46 cm) 3 LÉPÉSES Na-citrát gradiens PROGRAMMAL DETEKTÁLÁS: NINHIDRIN (post-column)

TERMÉSZETES AMINOSAVAK FMOC SZÁRMAZÉKAINAK ELVÁLASZTÁSA IONCSERÉLŐ KROMATOGRÁFIÁVAL

FEHÉRJE MOLEKULA SZERKEZETÉNEK IONOS, VAGY IONIZÁLHATÓ FUNKCIONÁLIS CSOPORTJAI

CELLULÁZ TRIPSZINES EMÉSZTÉSI TERMÉKEINEK ELVÁLASZTÁSA ANIONCSERÉLŐ (Mono Q) KROMATOGRÁFIÁVAL

KÍGYÓMÉREG ÖSSZETEVŐINEK ELVÁLASZTÁSA KATIONCSERÉLŐ FOLYADÉKKROMATOGRÁFIÁVAL

HbA1C ELVÁLASZTÁSA ÉS MÉRÉSE KATIONCSERÉLŐ (Mono S) KROMATOGRÁFIÁVAL

HUMÁN SZÉRUM LAKTÁT DEHIDROGENÁZ IZOENZIMEK ELVÁLASZTÁSA HORIZONTÁLIS AGARÓZ GÉLELEKTROFORÉZISSEL

LAKTÁT DEHIDROGENÁZ (LDH) IZOENZIMEK ELVÁLASZTÁSA KATION CSERÉLŐ FOLYADÉKKROMATOGRÁFIÁVAL

VIZELET FEHÉRJÉK ELVÁLASZTÁSA ANIONCSERÉLŐ (Mono Q) KROMATOGRÁFIÁVAL

- LIGHT CHAINS FEHÉRJE KIMUTATÁSA KÓROS VIZELETBEN (MYELOMA MULTIPLEX)

Idő (perc) AGP HSA Globulinok B % 100 50 AU280 Humán szérumból folyadék-folyadék fázisú extrakcióval nyert vizes-metanolos fázis savanyú alfa-1-glikoprotein (AGP) tartalmának elválasztása és tisztítása ioncserélő folyadékkromatográfiával Fractogel EMD TMAE 500M oszlopon (5X0.5 cm) gradiens elúcióval (A-puffer: 5 mM NaH2PO4 pH: 6.5, B-puffer: 350 mM NaCl A-pufferben). Szaggatott vonal: gradiens program, Egyéb szennyező fehérjék: HSA: humán szérum albumin, Globulinok.

NUKLEOTID FOSZFÁTOK ELVÁLASZTÁSA ÉS MÉRÉSE IONCSERÉLŐ MonoQ – FPLC FOLYADÉKKROMATOGRÁFIÁVAL MINTAELŐKÉSZÍTÉS: Szövetek, sejtek, biológiai folyadékok homogenizálva 0,7M perklórsavban, centrifugálás, felülúszó semlegesítve KHCO3-al FPLC oszlop: MonoQ, v. Polyanion SI HR 5/5 Áramló fázis: NH4-foszfát puffer, pH: 7, 0 Gradiens elúció: 0,1 – 1, 0 M Program szerint Áramlási seb: 0,75 mL/perc Detektálás: 254 nm

NUKLEOZIDOK ÉS NUKLEOTID FOSZFÁTOK ELVÁLASZTÁSA ION-PÁR HPLC FOLYADÉKKROMATOGRÁFIÁVAL (Ade, Cyt, Gua, Uri, CMP, UMP, GMP, IMP, CDP, UDP, AMP, GDP, CTP, UTP, GTP, ADP, ATP) MINTAELŐKÉSZÍTÉS: Szövetek, sejtek, biológiai folyadékok homogenizálva 0,7M perklórsavban, centrifugálás felülúszó semlegesítve KHCO3-al HPLC oszlop: Hypersil ODS (25x0,46 cm, 5 m) Áramló fázis: 0,025M TBAH-foszfát pH: 6,0 és 0,08M NaCl Lineáris gradiens elució: MeOH 0-20% (v/v) 45perc Áramlási seb: 0,75 mL/perc Detektálás: 254 nm

HPLC oszlop: Hypersil ODS (25x0,46 cm, 5 m) Áramló fázis: A HPLC-ION PÁR KROMATOGRÁFIA PARAMÉTEREINEK ÖSSZEFÜGGÉSE k’ VÁLTOZÁSA AZ ÁRAMLÓ FÁZIS MeOH ÉS NaCl TARTALMÁNAK FÜGGVÉNYÉBEN A NUKLEOTID FOSZFÁTOK ELVÁLASZTÁSÁNAK OPTIMÁLÁSA AZ ÁRAMLÓ FÁZIS MeOH és/vagy NaCl KONCENTRÁCIÓJÁNAK VÁLTOZTATÁSÁVAL HPLC oszlop: Hypersil ODS (25x0,46 cm, 5 m) Áramló fázis: 0,025M TBAH-foszfát pH: 6,0 (Optimálisan) 0,08M NaCl

NÉHÁNY FONTOSABB ANION IONKROMATOGRÁFIÁS ELVÁLASZTÁSA

NÉHÁNY FONTOSABB KATION IONKROMATOGRÁFIÁS ELVÁLASZTÁSA

Köszönöm a figyelmet

AGP HUMÁN SZÉRUM ELVÁLASZTÁSA ÉS MÉRÉSE ANIONCSERÉLŐ KROMATOGRÁFIÁVAL KETTŐS pH – NaCl GRADIENSSEL pH 7,5  9,5 NaCl 0  350 mM