A génműködés szabályozása Általános Genetika A génműködés szabályozása prokariótákban

adott pillanatban a géneknek csak egy része működik, Bármely sejtben adott pillanatban a géneknek csak egy része működik, a többi kikapcsolt állapotban van Konstitutív, housekeeping gének Regulált ahhoz, hogy a sejt ezt megvalósíthassa, szüksége van: 1. A gének ki és bekapcsolását végző mechanizmusra 2. Fel kell tudni ismernie azokat a körülményeket, melyek egy gén ki vagy bekapcsolását teszik szükségessé

A génműködés szabályozása több szinten megvalósulhat gén 1. A génátírás (transzkripció) ki-bekapcsolása és hatásfokának szabályozása 2. A mRNS érésének és életidejének szabályozása 3. A fehérjeképződés (transzláció) ki-bekapcsolása és intenzitása 4. A fehérjeműködés hatékonyságának szabályozása (poszttranszlációs módosítás, végtermék-gátlás) 5. A fehérje életidejének szabályozása által fehérje fenotípus

génkifejeződés szabályozás a transzkripció szintjén Prokarióta génkifejeződés szabályozás a transzkripció szintjén Gazdaságos Viszonylag lassú

1. A transzkripció iniciációjának befolyásolása: 1a) Szabályozó fehérjék kötődése a promóter közelében E.coli lac, ara, trp operonjai 1b) RNS-polimeráz szigma alegysége (s-faktor) által E. coli speciális szigma faktorai stressz stb. esetén B. subtilis sporuláció B. subtilis SPO1 fág fertőzése 2. A transzkripció terminációjának befolyásolása: attenuáció – génátírás csendesítése „korai” transzkripció terminációval E.coli trp operon antitermináció – génátírás folytatása terminációs szignál ellenére is lambda fág

A környezet kétféle módon tud hatni a transzkripcióra 1. A környezeti hatás bekapcsol inaktív gén(ek)t 2. A környezeti hatás kikapcsol működő gén(ek)t A lebontó folyamatok génjeire jellemző szabályozás Az építő folyamatok génjeire jellemző szabályozás A gének környezet általi ki-és bekapcsolása egyaránt szabályozó fehérjék közvetítésével valósul meg

Genetikai kapcsoló: szabályozó fehérje és annak target DNS-szekvenciája Szabályozó fehérjék: represszorok és aktivátorok Allosztérikus effektor: a szabályozó fehérje konformációját, ezáltal DNS-kötését befolyásoló kismolekula - korepresszor - koaktivátor - inducer Operátor régió: a represszor fehérje kötőhelye a DNS-en Pozitív szabályozás: átírás fokozása – aktiválással - gátlás megszüntetésével (indukció) Negatív szabályozás: átírás mérséklése - gátlással (represszió) - aktiválás felfüggesztésével OPERON: egy transzkripcionális egységet alkotó (közös promóterről policisztronos mRNS-re átíródó) gének csoportja, a szabályozó elemekkel együtt REGULON: közös mechanizmussal szabályozott operonok csoportja

A lac operon működésének felderítése Példa: A lac operon működésének felderítése (1950-es évek)

az enzim megjelenését a szubsztrát váltja ki A lac operon működésének felderítése (1950-es évek) Francois Jacob Jacques Monod Andre Lwoff Nobel díj 1965 E. coli laktóz metabolizmusában tanulmányozták az  ún. enzim "adaptáció" jelenségét az enzim megjelenését a szubsztrát váltja ki A laktóz hidrolízisét végző enzim, a b-galaktozidáz laktózzal és más galaktozidokkal is indukálható Izotóppal jelzett aminosavak segítségével bizonyították, hogy az enzim a laktóz adást követően újonnan szintetizálódik Miből "tudja" a sejt, hogy mikor kell termelni a megfelelő enzimeket?

b-galaktozidáz A b-galaktozidáz homotetramer enzim A b-galaktozidáz enzim mennyiségi meghatározását eleinte specifikus ellenanyaggal (antigalaktozidáz) végezték A b-galaktozidáz enzim nem mindig van jelen az E. coli sejtekben: csak akkor termelődik, ha laktóz kerül a táptalajba Az inducer (laktóz) eltávolítása leállítja az enzim szintézisét Tehát a sejtek ki-be tudják kapcsolni a géneket pl. környezeti szignálokra

> egyszerre szabályozódnak Gének együttes szabályozása Lac- fenotípus: a mutáns baktérium nem képes a laktózt hasznosítani (kizárólagosan laktózon nőni) Genetikai térképezés: > három gén, közvetlenül egymás mellett 1. lacZ b-galaktozidáz 2. lacY galaktozid permeáz 3. lacA galaktozid transzacetiláz Laktóz adásakor mindhárom gén indukálódik: > egyszerre szabályozódnak OPERON – egy génműködési egység (több gén + szabályozó elemeik, melyben a gének együttesen szabályozódnak) lacZ lacY lacA

Mesterséges galaktozid származékok A béta-galaktozidáz aktivitás kimutatására és az indukció kiváltására mesterséges galaktozid származékokat próbáltak ki Egyes vegyületek akár 1000x több enzim megjelenését indukálhatják (az alapszinthez képest)

A béta-galaktozidáz és a galaktozid transzacetiláz enzimek indukciója különböző galaktozid származékok hatására pl. az IPTG kiváló indukáló, de nem szubsztrátja az enzimnek (V=0) > Az indukció független a laktózbontástól (az enzimhez kötődéstől) Más az érzékelő és más a végrehajtó rendszer Előny az IPTG általi indukcióban, hogy nem fogy az indukció előrehaladtával

Kromogén szubsztrátok egyszerű az aktivitás követése, mert színes termék is keletkezik a reakció során X-gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D- galactopyranoside ONPG o-nitrophenyl beta-D-galactopyranoside

Szabályozásban hibás mutánsok kromogén szubsztátok megjelenése és az alapvető gének (lacZY) megismerése, térképezése > lehetőség nyílt különleges fenotípusú mutációk felismerésére is b-galaktozidáz aktivitást nem mutató illetve túltermelő törzsek könnyen azonosíthatók a színreakciókkal

Konstitutív és nem indukálható b-galaktozidáz mutánsok konstitutív mutáns: - akkor is termel b-galaktozidázt, amikor nincs jelen indukáló szer Ezeket úgy izolálták, hogy az E.coli mutált tenyészetét fenil-β-galaktozid, mint egyedüli szénforrás jelenlétében növesztették. Ez a galaktozid szubsztrátja ugyan a β-galaktozidáznak, de nem indukálja azt. Ezt csak azok a mutáns sejtek képesek hasznosítani, amelyek a β-galaktozidázt induktor hiányában is, konstitutívan termelik Azok a gének, amelyek elrontása a b-galaktozidáz konstitutív termelését eredményezi, ép állapotban gátolják az enzim termelését nem indukálható mutáns: - az indukálószer adása után sem jelenik meg az enzim aktivitása Izolálásuk: X-gal + IPTG > fehér kolóniák (a sok kék között) Azok a gének, melyek elrontása megakadályozza a laktóz bontó enzimaktivitás megjelenését, nélkülözhetetlenek az aktivitáshoz, beleértve az enzimet kódoló gént

Konstitutív és nem indukálható b-galaktozidáz mutánsok térképhelyzete A konstitutív mutánsok térképhelyzet alapján két lókuszt jelöltek ki lacI lacO lacZ lacY lacA A nem indukálható mutánsok két fő csoportja a lacZ és lacY területére térképeződött ezek a laktóz anyagcsere két fő enzimének mutánsai a lacA gén nem bizonyult nélkülözhetetlennek a laktóz bontáshoz

A lac operonra nézve részlegesen diploid (parciális diploid) törzsek létrehozása Az allélek dominanciaviszonyainak megállapítása I. Genotípus β-galaktozidáz enzimaktivitás indukálás nélkül β-galaktozidáz enzimaktivitás indukálással Fenotípus, következtetés I+Z+ (vad) – + ha I+, indukálható I-Z+ ha I-, konstitutív I+Z- ha Z-, nem indukálható I+Z- / F’ I-Z+ indukálható, I+ domináns I- felett, I+ transz módon hat A lacI gén terméke egy diffúzibilis represszor fehérje

A lac operonra nézve részlegesen diploid (parciális diploid) törzsek létrehozása Az allélek dominanciaviszonyainak megállapítása II. Genotípus β-galaktozidáz enzimaktivitás indukálás nélkül β-galaktozidáz enzimaktivitás indukálással Fenotípus, következtetés O+Z+ (vad) - + ha O+, indukálható OCZ+ ha OC, konstitutív OCZ- és O+Z- ha Z-, nem indukálható O+Z- / F’ OCZ+ konstitutív, OC cisz domináns módon hat A lacO egy cisz szabályozó elem (DNS-szakasz)

lacI lacO lacZ lacY lacA Az Operátor mutációk mindegyike a promóter és a Z lókusz közé eső 21bp-nyi szakaszra térképeződik lacI lacO lacZ lacY lacA P vad típus mutáns Az operátor mutánsok O szakaszának szekvencia változásai A szekvencia tükörszimmetrikus A mutánsokban megváltozó bázisok közvetlenül kapcsolódnak a represszorhoz

lacI lacO lacZ lacY lacA P LacI represszor tetramer (2x2 360 aa a-helix)

A lac promoter (P) A promóter (P) szakaszra eső mutációk (melyek az I és O gének közé térképeződnek) mindhárom gén transzkripciós kifejeződési szintjét csökkentik A P mutációk az RNS polimeráz kötődését befolyásolják.

A lac operon regulációs szakaszának szerkezete

A lac operon felépítése és negatív szabályozása

A lac operon pozitív szabályozása CAP (CRP) fehérje + cAMP komplex által valósul meg CAP = CRP katabolit cAMP aktivátor receptor protein protein Glükóz hiányában működik A sejtek két cukorforrás közül előbb a glükózt fogyasztják Amíg glükóz hozzáférhető a sejt számára, a lac, ara, mal, gal operonokról – a laktóz, arabinóz, maltóz, galaktóz indukció ellenére is – csak gyengén folyik az átírás – mert ilyenkor hiányzik a pozitív szabályozás

Katabolit represszió? A lac-operon: glükóz jelenlétében és laktóz hiányában represszált állapotban van glükóz hiányában és laktóz jelenlétében aktív (indukált) állapotban van glükóz és laktóz együttes jelenlétében azonban csak gyengén aktiválódik > a glükóz erős gátló befolyást gyakorol az operon működésére Kezdetben azt gondolták, hogy a glükóz bontás végtermékei (katabolitjai) gátolják (represszálják) az operon működését, ezért a jelenséget katabolit repressziónak nevezték el Később bebizonyosodott, hogy a feltételezés hibás, de a helytelen elnevezés ennek ellenére megragadt a szaknyelvben

A szabályozás a cAMP szinten keresztül érvényesül active transcription A glükóz katabolizmus a cAMP szintjére hat A katabolikus utak számos enzime katabolit repressziónak nevezett szabályozási folyamatnak van alávetve. Ha a sejtet gyorsan metabolizálható energiaforrással pl. glükózzal látjuk el, úgy megszûnik azoknak az enzimeknek a szintézise, melyek alternatív energiaforrások degradációjában vesznek részt. Így pl. a β-galaktozidáz szintézise sem következik be, ha glükóz van jelen. A β-galaktozidáz azonban csak egy azon sok enzim közül, 7 aminek szintézisét a glükóz gátolja. Valamennyi katabolit repressziónak alávetett enzim szintézise egy protein, a CAP (catabolite activator protein) pozitív kontrollja alatt áll. A CAP (amit gyakran cAMP receptor proteinnek, CRP-nek is hívnak) a katabolit represszálható enzimeket irányító gének szomszédságában a DNS-hez kötõdik, és aktíválja a gének átírását. Magát a CAP-ot viszont a 3', 5'-ciklusos AMP (cAMP) aktíválja. A CAP tehát önmagában nem képes a DNS-hez kötni, csak ha a cAMP aktíválja. Amikor egy gyorsan metabolizálható szubsztrát, mint amilyen a glükóz, a sejtmembránhoz kötõdik, a ciklusos AMP belsõ koncentrációja csökken, és a sejtben már szükségtelenné vált katabolit represszálható enzimek szintézise megáll. A cAMP ATP-bõl keletkezik adenilát-cikláz (AC) hatására, és a foszfodiészteráz enzim bontja AMP-vé. Alapvetõen a szintézis sebessége határozza meg az intracelluláris cAMP koncentrációt. Az adenilát-cikláz egy membrán kötött enzim, aminek aktivitását egy másik membrán kötött enzim, a IIIGlc befolyásolja. A IIIGlc fehérje a foszfotranszferáz transzport rendszer egyik eleme, ami a glükóz transzportjában játszik szerepet. Mûködése közben reverzibilisen foszforilezõdik, és glükóz jelenléte esetén foszfátját nagy sebességgel a glükóznak adja, az pedig glükóz-6-foszfáttá alakul. Az adenilát-cikláz nagy aktivitásához foszforilezõdésére van szükség, amit a IIIGlc katalizál, illetve adja át foszfátját. Glükóz jelenlétében ez a folyamat lassú, mert inkább a glükózra megy a foszfát, ezért az AC inaktív, és alacsony a cAMP szint. Glükóz hiány esetén azonban a IIIGlc foszforilezett formájának koncentrációja megnõ, gyorsan foszforilezi és aktíválja az AC-t, amitõl megnõ a cAMP szintje.

Az exogén glükóz gátolja: 1. a cAMP képződést (inaktív = nem foszforilált adenilát cikláz AC) 2. egyéb cukrok felvételét (pl. laktóz, inaktív permeáz) Kulcs: a IIAGlc foszforilált/defoszforilált formáinak aránya

A cAMP-CAP komplex DNS kötése erősíti a promótert A cAMP-CAP komplex egy tükörszimmetrikus DNS szekvenciát ismer fel a promóteren A komplex kötődése több mint 90o-al meggörbíti a promóter DNS-ét, ami előfeltétele a polimeráz stabil kötődésének

Negatív és pozitív szabályozás egymásra épülése Glükóz van (cAMP alacsony); laktóz nincs nincs átírás

Negatív és pozitív szabályozás egymásra épülése Glükóz van (cAMP alacsony); laktóz nincs nincs átírás („ereszt”) Glükóz van (cAMP alacsony); laktóz van gyenge átírás

Negatív és pozitív szabályozás egymásra épülése Glükóz van (cAMP alacsony); laktóz nincs nincs átírás Glükóz van (cAMP alacsony); laktóz van gyenge átírás Glükóz nincs (magas cAMP); laktóz van erős átírás

A lac operon elemeinek biotechnológiai alkalmazása Génexpressziós vizsgálatokban: a lacZ-t mint riportergént Fehérjeexpressziós rendszerekben: a szabályozható lac promótert Génklónozásban: kék-fehér teszt

Globális szabályozó mechanizmusok Jelentős környezeti változások pl. limitált tápanyagforrás stressz (ozmotikus, hő, oxigén) Több operon együttes szabályozása – REGULON Általában egy közös szabályozó fehérje által Pl. az ún. CAP-regulon tagjai: lac, ara, gal, mal operonok

kettős pozitív és negatív szabályozása Példa: Az ara operon kettős pozitív és negatív szabályozása

Kettős pozitív és negatív szabályozás az ara operonban az arabinóz cukor lebontásához szükséges enzimek génjeit és szabályozó elemeiket tartalmazza 3 struktúrgén kódolja az enzimeket: ara-A ara-B ara-D Az ara-C gén terméke arabinózzal kapcsolódva képes a promóterre (I) kötődni, ami lehetővé teszi a transzkripció elindulását. Erre ráépül még egy másik pozitív kontroll, a cAMP-CAP rendszer, mely azonos a lac-operonban megismerttel. Kettős aktiválás (pozitív szabályozás): AraC + arabinóz (induktor) CAP + cAMP

Kettős pozitív és negatív szabályozás az ara operonban Kettős aktiválás (pozitív szabályozás): AraC + arabinóz CAP + cAMP Represszió (negatív szabályozás): Arabinóz hiányában az Ara-C fehérje egy allosztérikus alakváltozás miatt most represszor szerepet játszik. Egyszerre kapcsolódik az araI promóterhez és az operátorhoz, ami egy transzkripciót gátló DNS hurkot eredményez.

finom szabályozás a transzkripció terminációjával Példa: A trp operon finom szabályozás a transzkripció terminációjával

A trp operon transzkripció Az E.coli triptofán szintézis útvonalának génjei a reakció sorrendnek megfelelő sorrendben találhatók a kromoszómán, és közös szabályozás alá esnek

Transzkripciós gátlás (represszió) a trp-operon szabályozásában nincs transzkripció triptofán-represszor komplex Trp = korepresszor A trp-operon transzkripciója negatív visszacsatolással szabályozódik: - magas triptofán szint esetén a trp-represszor komplex az operátorhoz kötődve gátolja a transzkripciót Meglepő: - a trp-represszor mutánsok még mindig képesek a génműködést szabályozni a triptofán koncentráció függvényében….

A trp operon finomszerkezete transzkripció (transzkripció terminációs jel)

A trp mRNS elejének (leader) kétféle másodlagos szerkezete lehet A színessel jelzett szekvenciák megfelelnek az előző ábrán ugyanígy jelzett szakaszoknak

A trp mRNS elejének (leader) kétféle másodlagos szerkezete lehet kodonok A színessel jelzett szekvenciák megfelelnek az előző ábrán ugyanígy jelzett szakaszoknak

Attenuáció (= transzkripció mérséklése) a trp operonban Ha kevés a trp a sejtben, a riboszóma hosszan kötésben tartja az 1-es szakaszt, mert az két triptofánt kódol. A lassú transzláció miatt a 2-3 kötés stabilizálódik, így 3-4 kötés nem alakulhat ki, ezért folytatódhat a transzkripció. Ha sok a triptofán a sejtben az 1-es szakasz gyorsan transzlálódik. Ez esetben a 2-3-as kötés nem alakulhat ki, így stabil 3-4 kötés jön létre, ami a transzkripció idő előtti terminációját okozza, vagyis nem íródnak át az enzimek génjei.

A transzkripció iniciációjának szabályozása speciális szigma (σ) faktorok által