Molekuláris biológiai módszerek

Az előadások a következő témára: "Molekuláris biológiai módszerek"— Előadás másolata:

1 Molekuláris biológiai módszerek
Vektorok

2 Klónozó és expressziós vektorok
Plazmidok Prokariota Eukariota Fágok M13 Lambda Kozmidok Mesterséges kromoszómák

3 Plazmidok 1. F plazmid (sex plazmid)
2. R plazmid: Antibiotikum rezisztencia 3. Col plazmid: Kolicinogén faktorokat termelnek (antibiotikum) más baktériumok ellen Önálló replikonok, ori replikációs origó, téta-replikáció, rolling-circle replikáció Fágemid vektorok

4 Lineáris konkatamer

5

6 Ampicillin Tetracycline Chloramphenicol Carbanecillin Transzpeptidázt gátol, sejtfal nem épül fel 30S alegységhez köt, AA-tRNS kötését gátolja Peptidil-transz- ferázt gátolja β-laktamáz 40 kDa membrán- protein, antiporter Chloramphenicol acyltransferase

7 Streptomycin Kanamycin 30S alegységhez kapcsolódik, formil- metionin kapcsoló- dását gátolja 30S alegységhez kapcsolódik, misz- transzlációt okoz Streptomycin foszfotranszferáz Kanamycin acyltransferase

8 Pro-, és eukarióta antibiotikumok
Zeocin Blasticidin Hygromycin B DNS-t vágja Peptidkötés kialakulását gátolja Fehérjeátíródás gátlása 2 módon is Zeocinhoz köt, inaktiválja Blasticidin- S-deaminase Hygromycin B phosphotransferase

9 A molekuláris klónozás főbb lépései

10 Klónozás ragadós végekkel

11 Klónozás tompa végekkel

12 Klónozás tompa végekkel + linkerekkel

13 Klónozás PCR-rel

14 A transzdukció mechanizmusa

15 Klónozás λ fágba λ-fág, mint vektor DNS λ-fág λ DNS
központi régió eltávolítása idegen DNS beültetése λ DNS λ „karok” in vitro „csomagolás” a kapszid fehérjékbe rekombináns, fertőzőképes λ-fág, mint vektor

16

17

18

19

20 M13 alapú vektorok

21

22 Szelekció

23

24 ONPG X-gal IPTG ortho-Nitrophenyl- β-galactoside (kolorimetria)
β-galactosidase repressor protein permease transacetylase ONPG X-gal IPTG ortho-Nitrophenyl- β-galactoside (kolorimetria) Isopropyl β-D-1- thiogalactopyranoside (aktiváció) kék-fehér szelekció

25 A kék-fehér szelekció genetikai háttere
lacI lacZω aminosavakat kódoló régió deléciója lacZα LacZα peptid aktív β-galaktozidáz X-gal kék színű termék inaktív IPTG LacI A kék-fehér szelekció genetikai háttere

26

27 transzdukció, vagy transzformáció
Fágemid vektorok kétféle replikáció, transzdukció, vagy transzformáció

28 Vektorok in vitro transzkripcióhoz

29 Kombinált klónozó/expressziós vektorok