Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Öröklött thrombophiliák laboratóriumi diagnosztikája Bereczky Zsuzsanna DEOEC, Klinikai Kutató Központ.

Hasonló előadás


Az előadások a következő témára: "Öröklött thrombophiliák laboratóriumi diagnosztikája Bereczky Zsuzsanna DEOEC, Klinikai Kutató Központ."— Előadás másolata:

1 Öröklött thrombophiliák laboratóriumi diagnosztikája Bereczky Zsuzsanna DEOEC, Klinikai Kutató Központ

2 Mi utal thrombophiliára? 1/ Mélyvénás thrombosis relatíve fiatal korban (<50-55 év) 2/ Recurrens thrombosis 3/ Thrombosis szokatlan helyen (nem alsó végtagon) 4/ Familiáris előfordulás (öröklött thrombophilia)

3 Öröklött thrombophiliák okai Az inhibitor rendszer deficienciája Antitrombin III deficiencia Heparin kofaktor II deficiencia? Az inaktivátor rendszer deficienciája Protein C, Protein S deficiencia Fokozott faktor szint vagy abnormális faktorok Aktivált protein C resisztencia (FV Leiden) Protrombin 20210A allél Dysfibrinogenaemia thrombosissal Magas FVIII, FIX, FXI szint ? Csökkent fibrinolítikus aktivitás Plazminogén deficiencia, FXII hiány? Egyéb Homocystinuria (hyperhomocysteinaemia)

4 APC rezisztencia - FV Leiden Egyéb ismert Ismeretlen A vénás thrombosisokra való fokozott hajlam genetikai okainak relatív gyakorisága AT III, protein C, protein S def. Protrombin A allél 40% 35% 10% 5%

5 1965. Egeberg et al. Öröklődés: AD (II/HBS: AR) Gyakoriság:1: (1: ) Thrombophiliák hátterében :3-5% Thrombosis kockázat:8-10x (LETS) Referencia taromány:75-120% Plazma szint heterozig.:30%-70% Tünetek (heterozigóták):MVT, PE, MeVT, CVT (ált. pubertas kor után) Homozigóta nincs:letális mutációk (I. típus és súlyos II. típus) Antitrombin III deficiencia

6 Öröklött antitrombin III hiány típusai I. Típus: Alacsony antitrombin aktivitás és antigén Okai: >80 mutáció (nagy deléciók, kisebb deléciók és inszerciók, egy nukleotid szubsztitúció) II. Típus:Abnormális antitrombin variáns RS, az aktív centrumra gyakorolt hatás HBS, a heparin kötő helyre gyakorolt hatás (kisebb a VTE kockázat) PE, pleiotróp (multiplex) hatás: kevés, abnormál AT szintézise ( a.savak)

7 II. típusú AT deficienciát okozó pontmutációk Bauer K A. 2003

8 Diagnózis: funkcionális (általában kromogén) teszt Klasszifikáció: antigén meghatározás 1 típus: csökkent aktivitás és antigén 2 típus: abnormális molekula- csökkent aktivitás, normál antigén Antitrombin III deficiencia diagnosztikája

9 AT III meghatározás I. Funkcionális tesztek 1. Alvadási tesztek módosított trombin idő meghatározás (defibrinált plazma, heparin kofaktor II és FDP zavar) 2. Kromogén tesztek Antitrombin aktivitás meghatározás Anti-faktor Xa teszt Heparin jelenlétében: “heparin kofaktor aktivitás” Heparin hiányában: “progresszív aktivitás” II. Antigén meghatározás Turbidimetria, nefelometria (ELISA, RIA, radiális immundiffúzió) III.Heparin kötés vizsgálata: 2DCIE

10 Heparin kofaktor aktivitás meghatározás kromogén szubsztráttal Heparin + AT III  Heparin - AT III komplex trombin (feleslegben)  Heparin - AT III + ————————— FXa (feleslegben)   Heparin - AT III - trombin + trombin (maradék) —————————————————————  Heparin - AT III - FXa + FXa (maradék) trombin R-pNA ———— R-COOH + pNA FXa R tr CBZ-Gly-Pro-ArgR xa : B z -IIe-Glu-Gly-Arg Ajánlás: FIIa alapú teszt esetén bovin trombin használata (HCFII!) de inkább FXa alapú teszt

11 Öröklött antitrombin III hiány típusai TípusAntigénHeparin kofaktorProgresszív Heparin aktivitás aktivitás affinitás* Ia  Normál Ib  Csökkent IIaNormál  Csökkent IIbNormál  Normál v. emelkedett IIc#Normál  Normál Csökkent *Heparin kötő teszttel meghatározva #IIc típusú heterozigóták: nincs (kisebb) fokozott thrombosis rizkó, öröklődésmenet AR

12 Fiziológiás/pathológiás állapotok melyek befolyásolják az AT III szintet újszülött kor, koraszülöttek terhesség 3. trimeszter, preeclampsia OAC, ösztrogén terápia májbetegség fehérje vesztő állapotok (enteropathiák, nephrosis) heparin terápia (15-30%)- fokozott clearance L-Aszparagináz terápia (ALL) DIC, MVT, PE

13 1981. Griffin et al. Öröklődés: AD/AR Gyakoriság:1:16,000/1:300 Thrombophiliák hátterében:3-5% Thrombosis kockázat:7x (LETS) Referencia tartomány:70-140% Plazma szint heterozigótákban:14%-70% Tünetek heterozigótákban MVT, PE, MeVT, CVT (AD forma): kumarin necrosis Homozigótákban < 5%, Neonatalis purpura (AD forma): fulminans, CVT Protein C deficiencia

14 Protein C meghatározás I. Funkcionális teszt 1. Alvadási teszt 2. Kromogén teszt II. Antigén meghatározás ELISA

15 Abszorpciós technikák: időigényes, PC kinyerés nem 100% (des-  -karboxi formánál különösen nem jó) Protac: Agkistrodon contortrix mérge, Ca 2+ - független, plazma proteázok nem inaktiválják Ajánlás: alvadási teszt jobb szűrőteszt

16 Protein C alvadási teszt Beteg plazma hígítás Kontroll plazma hígítás Protein C deficiens plazma APTI reagens (PL + aktivátor) Protac Inkubáció 240 sec, 37 o C-on Alvadás indítása: 25 mM CaCl 2 -vel

17 Protein C hiány típusai I. Normál PC molekula csökkent szintézise PC antigén , PC aktivitás  II. Kóros PC molekula a.PC antigén normál, PC aktivitás alvadás , kromogén  b.PC antigén normál, PC aktivitás alvadás , kromogén norm (a PS és PL kötés zavara- Gla-domén mutációk)

18 Fiziológiás/pathológiás állapotok melyek befolyásolják a PC szintet újszülöttkor, koraszülöttek májbetegség sepsis, DIC, akut thrombosis, PE ARDS postoperativ állapotok kemoterapeutikumok OAC kumarin terápia!!! terhesség, ösztrogének, nephrosis, ISZB heparin (poibrén) magas titerű LA (APTI reagens)

19 1984, Comp et al. Öröklésmenet: AD Gyakoriság: 1:16,000 A thrombophilia oka: 3-5% Plazma szint 30%-65% totál heterozigótákban: 15%-50% szabad A heterozigóták tünetei: MVT (szokatlan lokal.), PE, Sync. necr. arteriás thrombosisok thrombophlebitis Homozigóták: < 5%, MVT, PE neonatalis purpura fulminans Protein S deficiencia

20 Protein S hiány típusai I. Normál PS molekula csökkent szintézise csökkent szabad (és totál) PS antigén csökkent PS aktivitás II. Kóros PS molekula normál szabad (és totál) PS antigén csökkent PS aktivitás

21 Protein S meghatározás lehetőségei I. Antigén meghatározás 1. Totál PS (ELISA, immunturbidimetria) 2. Szabad PS (ELISA, ligand-kötő assay, immunturbidimetria) II. Funkcionális teszt - szabad PS aktivitását méri

22 Szabad protein S antigén meghatározás 1/Két dimenziós immunelektroforézis 2/C4bBP-PS komplex eltávolítása PEG precipitációval, a felülúszóban maradó szabad PS meghatározása ELISA-val 3/ Csak a szabad PS-t felismerő két monoklonális antitest segítségével egy lépéses szendvics ELISA 4/Ligand kötő assay ELISA lemezhez kötött C4bBP-t használnak a szabad PS megkötésére 5/Immunoturbidimetriás meghatározás, a szabad formát felismerő antitesttel

23 Protein S funkcionális teszt- APC kofaktor funkció Beteg plazma hígítás Referencia/Kontroll plazma hígítás Protein S deficiens plazma APTI reagens (PL + aktivátor)-FXa/Tromboplasztin (PI)/RVV (Faktor Va) Aktivált Protein C 240 sec inkubáció 37 o C-on 25 mM CaCl 2 Az alvadási idő megnyúlás mértéke arányos a vizsgálandó minta protein S aktivitásával. Ismert protein S aktivitású kalibrátor plazma alkalmazásával a másodpercben kapott alvadási idők protein S aktivitás értékekké konvertálhatók.

24 A protein S deficiencia diagnosztikáját nehezítő tényezők 1. Analitikai (metodikai), preanalitikai problémák: FVIII , LA, FV Leiden (II. típus!), heparin 2.PS szintet befolyásoló tényezők: PS csökkenés deficiencia nélkül 3. Szerzett PS deficienciák 4. Öröklött PS deficienciák: a genetikai diagnosztika problémái

25 A protein S szintjét befolyásoló (fiziológiás) tényezők nem, életkor, hormonális státusz, hormonpótlás, oralis anticoncipiensek (a C4bBP is  ), terhesség (2. trimeszterben akár 45% alá is csökkenhet) 1 nap FT 1 nap PT 1 hó FT 1 hó PT 6 hó FT 6 hó PT felnőtt 36 (24-48) 26 (14-38) 63 (48-78) 56 (22-90) 87 (71-103) 82 (44-120) 92 (60-124) életkor PS szint (%) Andrew, 1987, 1988, 1992FT: érett úsz., PT: koraszülött

26 Gyulladás C4bBP  Szerzett PS deficiencia SLE MM, tu. L-aszparagináz Kumarinterápia, K-vitamin def. májbetegség DIC, Akut thrombosis APS Varicella,HIV NephrosisC4bBP>PS:Ag

27 Öröklött PS deficiencia genetikai diagnosztikája A genetikai defektus jelenlétével legjobban a szPS korrelál (II. típus nagyon ritka) Problémák: nagy gén, ezért a diagnosztika időigényes, pszeudo-gén pszeudo-gén miatt a PCR primerek tervezése nehézkes, a deficiencia hátterében nem mindig található meg a mutáció (intragén polimorf markerekkel, Southern blottal nagyobb gén defektusok azonosítása) Eddig több mint 150 különböző mutációt írtak le PROS1 adatbázis Polimorfizmusok: Pro626 CCA-CCG, intronK C54T, alternatív poliA szekvenciák, Ser460Pro: PS Heerlen- fokozott affinitás C4bBP-hez

28 Protein S gén-exon 9 A B

29 Protein S mutációs adatbázis Mutáció típusaElőfordulási gyakoriság Nukleotid szubsztitúció80% Misszensz mutáció60% Nonszensz mutáció23% Splice site mutáció17% Inszerciók/deléciók  20% Nagy deléciók<1% Homozigóta vagy összetett heterozigóta: az esetek 3%-a II. típusú deficiencia: az esetek 5%-a

30 Arg506 Aktivácó: limitált proteolízis trombinnal A1A2BA3C2C1 Arg709Arg1018Arg1545 Ca 2+ Inaktiváció: proteolítikus hasítás aktivált Protein C-vel (első hasítási hely Arg 506-nál) A1A2A3C2C1 A faktor V aktivációja és inaktivációja Arg306 Arg679

31 APC rezisztencia: Dahlback Az APC rezisztencia kimutatása: funkcionális alvadási teszt A Leiden mutáció kimutatása: molekuláris genetikai módszerek Az öröklött APC rezisztenciáért szinte kizárólag a Leiden mutáció a felelős. Thrombosis kockázataheterozigótákban: 5-7x homozigótákban: 80x FVL+OAC: 35x

32 Az APC rezisztencia funkcionális meghatározásának elve A plazmához hozzáadott aktivált protein C (APC) proteolítikusan degradálja az aktív V-ös és VIII-as faktorokat, ami az e két faktort (vagy egyiket) magában foglaló alvadási tesztben alvadási idő megnyúlást eredményez. Ha az V-ös (esetleg VIII-as) faktor APC által történő degradációja lassúbb a faktorban bekövetkezett kóros strukturális változás miatt, APC rezisztenciáról beszélünk. Ez esetben az alvadási idő APC hatására történő megnyúlása lényegesen kisebb. II. generációs tesztek! (FVIII, LA, heparin, kumarinok)

33 *1:5 hígítás FV hiányos plazmával APC-R = APTI APC+CaCl 2 APTI CaCl 2 Referencia tartomány: ≥ 2.0

34 Leiden mutációra vad típusú, heterozigóta és homozigóta betegek REA-clot APC-R (V.) teszttel mért APC rátái Vad típus n=48 Heterozigóta n=9 Homozigóta n=2 APC ráta

35 Olvadáspont analízis (FV Leiden) vad típus heterozigótahomozigóta

36 Faktor V Leiden mutáció hordozás gyakorisága Magyarország:~10%(K-Mo.:9,2%, Ny-Mo.:6,2%) UK: 3% Hollandia: 3% Franciaország: 3.5% Németország: 7% Spanyolország: 3% Törökország: 10% Görögország: 10% Svédország: 10% Finnország: 3%

37 Hordozása szeres relatív kockázatot jelent mélyvénás thrombosisra. A familiáris thrombophiliák kb. 10%-áért felelős. Egyéb thrombophiliás állapotokban hordozása tovább fokozza a thromboembolia kockázatát. Mutáció: a protrombin gén 3’ át nem íródó szekvenciájában guanin-adenin csere. Következmény: szignifikáns plazma protrombin szint emelkedés magasabb transzlációs efficiencia vagy stabilabb mRNS képződése révén. Karrier frekvencia: K-Mo.: 4,4%, Ny-Mo.: 3,8% Protrombin 20210A allél

38 Thrombophilia szűrés - ajánlások 1. Egyértelműen ajánlott: rekurrens VTE, 50 éves kor előtt jelentkező VTE, nyilvánvaló kiváltó tényező hiányában kialakult VTE bármely életkorban szokatlan lokalizációban jelentkező VTE VTE terhességben, puerperiumban, OAC, vagy hormonpótló terápiában 2. Megfontolandó: 50 év alatti dohányos nők AMI 50 év felettiek ismert kiváltó tényező jelenlétében kialakult VTE (nincs tu) terhességi komplikációk (pl. preeclamsia) tünetmentes családtagok (főleg nők) 3. Nem ajánlott: általános populációs szűrőtesztként prenatalis tesztként, tünetmentes gyermekek szűrésére artériás thrombosisokban (vannak kivételek, pl. fiatal betegek atherosclerosis nélkül) OAC, hormonpótlás előtt (teljes panel) Aiach M, Emmerich J. 2006

39 Thrombophilia szűrése ParaméterMódszer APC rezisztenciaII. generációs funkcionális teszt FII 20210Amolekuláris genetikai vizsgálat Antitrombin IIIheparin kofaktor aktivitás Protein Cfunkcionális alvadási teszt Protein Sfunkcionális alvadási teszt+szabad PS ag DysfibrinogenaemiaTI, fibrinogén (funkc.+immun.) Homociszteinéhgyomri APSLA + AP antitestek Vizsgálat időzítése: kerüljük az akut thrombosisban, kumarin terápia alatt, nagy dózisú heparin terápia alatt, újszülött korban, terhességben történő kivizsgálást.

40


Letölteni ppt "Öröklött thrombophiliák laboratóriumi diagnosztikája Bereczky Zsuzsanna DEOEC, Klinikai Kutató Központ."

Hasonló előadás


Google Hirdetések