Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

1, GÉNKÖNYVTÁRAK ALKALMAZÁSA 2, EXPRESSZIÓS RENDSZEREK 3, FEHÉRJE INTERAKCIÓN ALAPULÓ TECHNIKÁK 4, IN VITRO MUTAGENEZIS Buday László.

Hasonló előadás


Az előadások a következő témára: "1, GÉNKÖNYVTÁRAK ALKALMAZÁSA 2, EXPRESSZIÓS RENDSZEREK 3, FEHÉRJE INTERAKCIÓN ALAPULÓ TECHNIKÁK 4, IN VITRO MUTAGENEZIS Buday László."— Előadás másolata:

1 1, GÉNKÖNYVTÁRAK ALKALMAZÁSA 2, EXPRESSZIÓS RENDSZEREK 3, FEHÉRJE INTERAKCIÓN ALAPULÓ TECHNIKÁK 4, IN VITRO MUTAGENEZIS Buday László

2 GÉNKÖNYVTÁRAK ALKALMAZÁSA Buday László

3 Teljes DNS kivonat: pl. teljes genomiális DNS vagy teljes cDNS adott szövetből Specifikus amplifikáció (DNS klónozás) Specifikus kimutatás PCR alapú in vitro DNS klónozás Sejt alapú klónozás Molekuláris hibridizáció 1. megfelelő gazdasejt 2. vektor 3. A klónozni kívánt gén ligálása a vektorba, majd a gazdasejt transzfekciója 1. Termostabil DNS Polimeráz 2. A klónozni kívánt DNS szakasz legalább részleges ismerete -- oligonukleotidok 1. Jelzett DNS vagy RNS próba 2. Eljárás, mellyel kimu- tatjuk a próbát kötő géneket

4 EGY GÉN PLAZMID VEKTORBA VALÓ KLÓNOZÁSÁNAK ÁLTALÁNOS MENETE I. Molecular Cell Biology, Lodish, 1995 American Scientific Books

5 EGY GÉN PLAZMID VEKTORBA VALÓ KLÓNOZÁSÁNAK ÁLTALÁNOS MENETE II. Molecular Cell Biology, Lodish, 1995 American Scientific Books

6 E. coli PLAZMIDOK HASZNÁLATÁNAK KORLÁTAI 1, Rövid DNS szakaszok befogadására alkalmasak (maguk a plazmidok 3-10 kb nagyságúak) 2, E. coli transzformációjának rossz hatásfoka (elektroporáció, hő-sokkolás, stb. – fizikális behatások) 3, Maximum néhány száz egyedi E. coli kolónia vizsgálható egy 10 cm-es petri csészében Ha pl. az emberi genomot (3 x 10 9 bp) szeretnénk E.coli-ban kifejezni, ez lehetetlen lenne. Megoldás másik vektor λ –bakteriofág használata

7 A LAMBDA-BAKTERIOFÁG SZERKEZETE Fertőzésnél a fág az E.coli felszínén található receptorhoz kötődik és a baktériumba lövi a DNS-ét. Molecular Cell Biology, Lodish, 1995 American Scientific Books

8 A λ-FÁG SZERKEZETE II. (kb. 60 gént kódol) Fej Nyak Lítikus funkció Tetszőleges génre kicserélhető fág DNS darab (kb kb nagyságú gént lehet ide klónozni) Az itt kódolt gének nem nélkülözhetetlenek a fág-fertőzéshez

9 MIÉRT ELŐNYÖS TEHÁT A λ-FÁG A PLAZMIDDAL SZEMBEN? 1, Nagyobb DNS darabot lehet bele klónozni 2, Receptorhoz kötődve a baktérium felszínén kb. 1000x jobb hatásfokkal juttatja be a DNS-t az E.coli-ba, mint az plazmiddal történő transzformáció esetén történik Eukarióta sejtek genomját tipikusan olyan restrikciós enzimmel emésztik meg, mely 4-bázispár hosszú DNS szekvenciát ismer fel. Ilyen a Sau3A vagy MboI, melyek 4 4 =256 bázispáronként hasítanak. Ezek a fragmentek túl kicsik lennének, ezért részleges emésztés történik, pl. alacsony enzim koncentrációval és rövid emésztési idővel. Így kb. 20 kb DNS fragmentek jönnek létre (ezek a fágba illeszthetőek).

10 HUMÁN GENOM: 3 x 10 9 bp 20 kb (2 x 10 4 bp) 1,5 x 10 5 darab rekombináns fág Ezek összességét nevezzük GÉNKÖNYVTÁRNAK Sajnos a 1,5 x 10 5 db DNS-ben átfedő szekvenciák is vannak, ezért kb rekombináns fág szükséges ahhoz, hogy a teljes humán genom 90-95%-os valószínűséggel reprezentálva legyen.

11 A lambda-fággal való munka során nagyon kis méretű ún. plakkokat lehet az E-coli réteget tartalmazó petri csészében felismerni: azaz egy petri csészében kb. 5 x 10 4 plakkot lehet vizsgálni Tehát petri csészében lehet a teljes emberi genomot vizsgálni Érdekesség: ha sikerülne a humán genomot recombináns plazmidban előállítani (10 6 db plazmid), akkor a genom vizsgálatához 5000 petri csésze kellene (kb. 200 E. coli kolóniát lehet egy petri csészén vizsgálni).

12 EGYÉB VEKTOROK Vektor típusa DNS hossza (kb) Plazmid5-15 λ-bakteriofág10-25 Cosmid30-45 P1 bakteriofág vektor BAC (bacterial arteficial chromosome)max. 300 YAC (yeast arteficial chromosome) A DNS maximális hossza, amit a vektorokba lehet klónozni.

13 cDNS KÖNYVTÁR -- míg egy állat vagy ember összes sejtmaggal rendelkező sejtje ugyanazzal a génállománnyal rendelkezik, addig a különböző tipusú sejtek, illetve szövetek eltérő fehérje-mintázatot expresszálnak -- pl. ALBUMIN-t csak májsejtek termelnek, így albumint kódoló mRNS csak májsejtekben szintetizálódik -- ha izoláljuk az adott sejttípusban megtalálható összes mRNS-t, majd ezekről REVERZ TRANSZKRIPTÁZ segítségével COMPLEMENTÁRIS DNS-t (cDNS) készítünk és az összes cDNS-t plazmidba vagy fágba klónozzuk, akkor ún. cDNS KÖNYVTÁRHOZ jutunk Fontos: a génkönyvtár azonos minden ember minden sejtmaggal rendelkező sejtjében (ezért gyakran vérsejtekből készítik), míg a cDNS könyvtár sejttől, szövettől függően eltérő!!!

14 cDNS KÖNYVTÁR KÉSZÍTÉSÉNEK MENETE Human Molecular Genetics Strachan & Read, 1999 BIOS Scientific Publisher Ltd.

15 EGY ADOTT GÉN KIVÁLASZTÁSA GÉN- VAGY cDNS KÖNYVTÁRBÓL HIBRIDIZÁCIÓVAL TÖRTÉNIK Dupla szálú DNS DNS megolvasztása Egyszálú DNS Filterhez kötés Jelölés jelzett DNS próbával Hibridizált DNS Nem kötődő DNS próbák kimosása Autoradiográfia

16 HIBRIDIZÁCIÓS PRÓBÁK FAJTÁI Human Molecular Genetics Strachan & Read, 1999 BIOS Scientific Publisher Ltd.

17 A HIBRIDIZÁCIÓRA ALKALMAS PRÓBÁK JELÖLÉSE Lehet: 1, Izotóppal jelölni ( 3 H, 32 P, 33 P, 35 S) 2, Nem izotópos jelölés a, fluoreszcens festékek b, biotin-straptavidin c, digoxigenin (specifikus ellenanyag van ellene) A JELÖLÉSE MÓDJA (in vitro) SZERINT LEHET: 1, DNS jelölés „nick” transzláció segítségével 2, DNS jelölés random primerek segítségével 3, Jelölés PCR segitségével 4, DNS végének jelölése

18 DNS JELÖLÉS RANDOM PRIMEREK SEGÍTSÉGÉVEL Random primer: minden lehetséges variációja a hexanukleotidnak Human Molecular Genetics Strachan & Read, 1999 BIOS Scientific Publisher Ltd.

19 EGY GÉN AZONONOSÍTÁSÁNAK ÁLTALÁNOS MENETE GÉN- VAGY cDNS KÖNYVTÁRBÓL Molecular Cell Biology, Lodish, 1995 American Scientific Books

20 A NUKLEINSAVAK HIBRIDIZÁCIÓJÁNAK OPTIMALIZÁLÁSA A hibridizáció hatásfoka függ: a denaturáló hőmérséklettől a só koncentrációtól (NaCl) a próba/nukleinsav aránytól a próba és DNS komplementaritásától Human Molecular Genetics Strachan & Read, 1999 BIOS Scientific Publisher Ltd.

21 A HIBRIDIZÁCIÓ HŰSÉGE (HYBRIDIZATION STRINGENCY) Ha csökkentjük a hibridizáció hőmérsékletét, illetve emeljük a a hibridizáció reakcióelegyében NaCl koncentrációját, akkor csökkentjük a hibridizáció hűségét: a próba és a kihalászott nukleinsav szekvenciája nem lesz teljesen komplementer ez nagyon fontos megfigyelés, mely alapja lehet homológ gének, illetve új géncsaládok azonosításának, klónozásának

22 ISMERT NUKLEINSAV HIBRIDIZÁCIÓS TECHNIKÁK ELJÁRÁS NEVE A KIMUTATANDÓ NUKLEINSAV Dot-blot DNS, RNS minta, egy helyre felcsöppentve a membránra Southern-blot Gyakran genomiális DNS, gélelektoforézissel elválasztva, membránhoz kötve Northern-blot Teljes sejt-RNS vagy mRNS, gélelektroforézissel elválasztva, membránhoz kötve KoromoszómaGyakran metafázisos kormoszómák (DNS), in situ hibridizációtárgylemezen Szöveti in situ Tárgylemezen fixált sejtek RNS-e hibridizáció

23 REVERZ NUKLEINSAV HIBRIDIZÁCIÓS TECHNIKÁK ELJÁRÁS NEVE A KIMUTATANDÓ NUKLEINSAV Reverz Dot-blot oligonukleotidok egy helyre felcsöppentve a membránon DNS microarray (DNS chip) DNS klónok robot segítségével rögzítve tárgylemezekre Oligonukleotid microarray oligonukleotidok robot segítségével rögzítve tárgylemezekre

24 SOUTHERN ÉS NORTHERN BLOT ELVE Human Molecular Genetics Strachan & Read, 1999 BIOS Scientific Publisher Ltd.

25 PÉLDA A NORTHERN-BLOT ELJÁRÁSRA Human Molecular Genetics Strachan & Read, 1999 BIOS Scientific Publisher Ltd.


Letölteni ppt "1, GÉNKÖNYVTÁRAK ALKALMAZÁSA 2, EXPRESSZIÓS RENDSZEREK 3, FEHÉRJE INTERAKCIÓN ALAPULÓ TECHNIKÁK 4, IN VITRO MUTAGENEZIS Buday László."

Hasonló előadás


Google Hirdetések