Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

„az emberek hazudnak, de a bizonyítékok nem” Bizonyítékok típusai: -indirekt (pl. fotó) -direkt (pl. haj) -„hideg nyom” (textil) -„forró nyom” (DNS)

Hasonló előadás


Az előadások a következő témára: "„az emberek hazudnak, de a bizonyítékok nem” Bizonyítékok típusai: -indirekt (pl. fotó) -direkt (pl. haj) -„hideg nyom” (textil) -„forró nyom” (DNS)"— Előadás másolata:

1

2 „az emberek hazudnak, de a bizonyítékok nem” Bizonyítékok típusai: -indirekt (pl. fotó) -direkt (pl. haj) -„hideg nyom” (textil) -„forró nyom” (DNS)

3 A gyakorlat: 0. mintagyűjtés a helyszínen 1.DNS extrakció 2.DNS amplifikáció (PCR) 3.DNS festés és elválasztás (gélelektroforézis) 4.Minták összevetése

4 Személyazonosság DNS-ujjlenyomat alapján •Törvényszéki esetek – gyanúsított és bizonyíték egyezés bizonyítása •Apasági teszt– (mater semper certa est pater nunquam) •Tömegkatasztrófa esetek– •Történelmi sírok azonosítása •Eltűnt személyek azonosítása •Katonai DNS-dögcédula •Elkövetők DNS adatbázisának létrehozása Ugyanazok az STR markerek (short tandem repeat) használhatóak

5 Forensic Sciences 1.Igazságügyi Pszichiátria 2.Igazságügyi Pathológia 3.Igazságügyi Toxikológia 4.Igazságügyi Kriminalisztika 5.Igazságügyi Rovartan 6.Igazságügyi Fogászat 7.Igazságügyi Epidemiológia stb.

6 Igazságügyi Rovartan: A Magyarországon előforduló légyfajok fejlődésének üteme holttesten: (Schranz Dénes nyomán)

7 A DNS ujjlenyomatvizsgálat elméleti alapjai Minden egyes ember egyedi genommal rendelkezik (kivéve az egypetéjű ikreket!). A genomunkat a szüleinktől örököljük. Genetikai variációk sorozatát használhatjuk a különbözőség statisztikai valószínűségének megállapítására A DNS minta információ tartalmát hatékonyan és reprodukálhatóan kell kinyerni (a bíróság több év után is kérhet új vizsgálatot) A jelenlegi DNS-ujjlenyomat standardok nem géneket vesznek figyelembe, a fenotípus tulajdonságairól (rassz, betegségek, hajszín, stb) kevés/semmilyen információt nem kapnak. De a 3. generációs szekvenálással a jövőben minden ismert lesz?

8 A DNS, mint bizonyíték •Mit lehet bizonyítani? Csak az USA-ban 313 esetben engedtek szabadon olyan embereket, akikről a DNS profil vizsgálat bevezetése után derült ki, hogy ártatlanul ítélték el őket

9 Igazságügyi DNS vizsgálatok rövid története 1900-as évek: Landsteiner felfedezi az AB0 vércsoportokat, a szerológia tudománya forradalmasítja a törvényszéki vizsgálatokat. Az elkülönítési próba ereje: kb as évek: RFLP + Southern blot: Alec Jeffreys kidolgozza az első genetikai marker alapú elkülönítést betegségekre. 6 Southern próbával az elkülönítés ereje: , személyazonosításra is alkalmazzák. 1984: A Colin-Pitchfork ügy Angliában : először alkalmaz a bíróság DNS alapú bizonyítékot két meggyilkolt diáklány esetében Narborough környéki férfi önkéntes véradása útján megtalálják a gyilkost. Hátrányok: nagy mennyiségű ( ng) tiszta, nagy molekulasúlyú DNS kell hozzá, nem ideális a gyakran degradálódott mintákhoz Sir Alec Jeffreys

10 1984: Karry Mullis kidolgozza a PCR technikát •Sokkal kevesebb (1-2ng), rossz minőségű minta is elég hozzá •A próba ereje egy szekvencia esetén ,ami kevés az elkülönítéshez 1986: PCR + STR: nem kódoló, 4-7 ismétlődésekből álló, egyénenként változó kromoszóma szakasz vizsgálata. Nagyon kevés DNS-t igényel (<1ng), az elkülönítési próba ereje A Föld lakossága 10 9 nagyságrendű! 1987 az FBI és NIH támogatásával létrehozzák a Combined DNA Index System (CoDIS) adatbázist. Ebbe helyszínelési minták és elkövetők anyagai egyaránt bekerülnek. Jelenleg kb. 9M adatot tartalmaz es évek: a DNS vizsgálat megkérdőjelezhetetlen igazságügyi bizonyítéknak van feltüntetve. „Olyan esetekben, ahol 1:33 Mrd az esélye annak, hogy nem a tettes DNS-ét találták meg nincs is szükség bíróságokra!” - Robert Brower főügyész Igazságügyi DNS vizsgálatok rövid története

11 az O.J. Simpson ügy On June 12, 1994, O.J.’s ex girlfriend Nicole Brown and her new friend Ronald Goldman were found dead outside Brown's condominium Az évszázad pere: “Dollárok vs. DNS” vagy „California vs. OJ Simpson” 1995: OJ Simpson-t az esküdtszék Felmentette!

12 Technika sebessége próba ereje (genetikai elkülönítés) alacsony magas lassúgyors Igazságügyi eljárásban használt genetikai markerek összehasonlítása RFLP Multi-Locus Próbák ABO vércsoport Multiplex PCR STRs mtDNS PCR: Figure 1.1, J.M. Butler (2005) Forensic DNA Typing, 2 nd Edition © 2005 Elsevier Academic Press

13 Igazságügyi DNS vizsgálat markerei ma: STR: 2-7 bp ismétlődő egységekből álló allélok, a centromer környékén, egyénenként változó méretűek. Az FBI 1996-ban létrehozott CODIS adatbázisa ezen alapul. Y-STR: az Y kromoszómaspecifikus STR allélok az apai leszármazást mutatják. A férfi nem megállapításánál (szexuális bűncselekmények) használt lókuszok. Mitokondriális DNS: a sejtmag nélküli sejtekben is van (haj, fog, csont), de csak az anyai leszármazás egyezésére/kizárására alkalmas. A történelmi sírok ill tömegsírok vizsgálatánál alkalmas lehet a degradált nukleáris DNS vizsgálat helyettesítésére. (Romanov család, vietnámi sírok) Mini-STR: degradált minták esetén a sejtmagi STR-ek alternatív lehetősége: egészen kicsi DNS fragmentek amplifikációjával. (2001 szept.11. maradványok esetén pl. ezt használták.) SNPs: egyetlen bázis amplifikációjával és populációs gyakoriságának összehasonlításával

14 Minisatellite Marker (D1S80) GAGGACCACCAGGAAG Repeat régió Határoló (flanking) régiók 16 bp repeat egység STR Marker (TH01) TCAT Repeat régió 4 bp repeat egység Figure 5.1, J.M. Butler (2005) Forensic DNA Typing, 2 nd Edition © 2005 Elsevier Academic Press Határoló (flanking) régiók

15 2 repeats 3 repeats AGACTAGACATT AGATTAGGCATT (AATG)(AATG)(AATG) (AATG)(AATG) (A) Hossz polimorfizmus: VNTR és STR – Technika : VNTR-PCR (B) Szekvencia polimorfizmus: SNP – Technika : ASA Figure 2.5, J.M. Butler (2005) Forensic DNA Typing, 2 nd Edition © 2005 Elsevier Academic Press Polimorfizmusok a homológ kromoszómákon és technikai vizsgálatuk

16 A védelem „Dzsingisz kán érvelése”: Az apai rokonok mind tartalmazzák a hasonló Y-STR haplotípusokat (pl.10%-a a közép-ázsiaiaknak hordozza feltehetőleg Dzsingisz kán haplotípusát) Y-STR Problémák: •A klasszikus bűncselekmények ~99%-át a férfiak követik el… Csak a férfi Y kromoszóma lókuszai amplifikálhatók vele: ha a PCR hatékonysága nem egyenlő a női és férfi STR-ek esetén, jól használható

17 Heavy (H) strand Light (L) strand Figure 10.1, J.M. Butler (2005) Forensic DNA Typing, 2 nd Edition © 2005 Elsevier Academic Press Hypervariable Region2Hypervariable Region1 Mitochondria Előnyök: •Egyetlen sejt tartalmaz ~1000 mt-ot, 1 sejt szenzitivitás •Égett minták esetén, haj, csontmaradványok esetén jó •Anyai rokonságot közvetlenül mutatja Előnyök: •Egyetlen sejt tartalmaz ~1000 mt-ot, 1 sejt szenzitivitás •Égett minták esetén, haj, csontmaradványok esetén jó •Anyai rokonságot közvetlenül mutatja Hátrányok: Heteroplasmia – nem homogén mt. populáció a sejtekben Hátrányok: Heteroplasmia – nem homogén mt. populáció a sejtekben Mitokondriális DNS (mtDNS)

18 Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) •Pontmutációk (bázis szubtitúciók), amelyek gyakorisága 1%-nál nagyobb a populációban •5 Millió található kb. a humán genomban •Minden-Semmi válasz kapható •~50 SNPs ugyanakkora erővel jósol jó kizárást, mint a 13 STR lokusz •A magáncégek is alkalmazzák populációgenetikai vizsgálatoknál

19 Biológiai minták, mint bizonyítékok •vér •ondó •nyál •vizelet •haj •fog •csont •szövet VÉR: 3ul elegendő a DNS- kivonáshoz

20 SZERVES SZŰRŐPAPÍR CHELEX lyukasztás Mosás extrakciós pufferben PCR Reagensek SDS, DTT, EDTA proteinase K INKUBÁLÁS (56 o C) Phenol, chloroform, isoamyl alcohol Vér beszárítása a speciális szűrőpapíron vér VORTEX DNS cc mérés nélkül PCR végrehajtása víz INKUBÁLÁS 5% Chelex INKUBÁLÁS(100 o C) INKUBÁLÁS (56 o C) DNS cc. mérés PCR végrehajtása CENTRIFUGÁLÁS Centrifuge Felülúszó ELTÁVOLÍTÁSA Vizes fázis új csőbe DNS KONCENTRÁLÁS (ethanol precipitation) TE puffer Felülúszó ELTÁVOLÍTÁSA vér DNS cc. mérés PCR végrehajtása Figure 3.1, J.M. Butler (2005) Forensic DNA Typing, 2 nd Edition © 2005 Elsevier Academic Press DNS-extrakciós protokollok

21 Elkövető spermiumai és áldozat epitélsejtek összekeveredve centrifugálás Felülúszó eltávolítása SDS, EDTA és proteinase K (sejtlízis puffer) mintavétel SDS, EDTA és proteinase K + DTT inkubálás 37 o C spermium pellet DTT lizálja a spermium fejeket “Férfi fázis” “Női fázis” spermium pellet Figure 3.2, J.M. Butler (2005) Forensic DNA Typing, 2 nd Edition © 2005 Elsevier Academic Press Differenciál DNS extrakció törvényszéki mintából: áldozat epitélsejtjeinek elkülönítése spremiumoktól Differenciál DNS extrakció törvényszéki mintából: áldozat epitélsejtjeinek elkülönítése spremiumoktól DTT: Dithiothreitol: spermium fehérjebontása

22 Laser Inlet Buffer Capillary filled with polymer solution 5-20 kV -+ Outlet Buffer Sample tray Detecti on window (cathode) (anode) Data Acquisition Sample tray moves automatically beneath the cathode end of the capillary to deliver each sample in succession Kapillárisok Elektródák a folyadék injekcióhoz Kapilláris Gélelektroforézis Mi a technikai alapja az STR lókuszok vizsgálatának? Fluoreszcensen jelölt primerekkel

23 CODIS (Combined DNA Index System, developed by FBI and NIH) Nem-specifikus marker Kromoszóma szám

24 FBI’s core STR Lókuszok: 13

25 Kibővített STR lókuszok az FBI, InterPol, stb. használatában

26 D3S1358 (8 alleles) VWA (14 alleles) D16S539 (9 alleles) D2S1338 (14 alleles) Blue panel Green panel Yellow panel Orange panel D21S11 (24 alleles) D8S1179 (12 alleles) D18S51 (23 alleles) TH01 (10 alleles) FGA low (19 alleles) FGA high (9 alleles) 250 bp* 139bp 200 bp 160 bp 300 bp 340 bp 350 bp 150 bp LIZ-labeled GS500 DNA sizing standard 100 bp Red panel D19S433 (15 alleles) D5S818 (10 alleles) TPOX (8 alleles) D13S317 (8 alleles) D7S820 (10 alleles) CSF1PO (10 alleles) AMEL (2 alleles) Figure 5.6, J.M. Butler (2005) Forensic DNA Typing, 2 nd Edition © 2005 Elsevier Academic Press

27 Hogyan értelmezzük a CODIS file STR kromatogrammokat? GeneScan: Genotyper: Allél (repeatek száma): az azonos körülmények között Futtatott referencia mintával hasonlítva pontosan megadja a repeatek számát Peak magasság: relativ fluorescencia unit (RFU) STR lókusz neve

28 Helyszíni STR Profil összevetése 2 gyanúsítottéval 3 lókusz alapján Gyanúsított 1 Gyanúsított 2 Bizonyíték Exklúzió: Nincs találat Inklúzió: Van találat

29 A jövő/jelen igazságügyi tudománya? Egy Genome-Wide Association vizsgálat 5 lókuszt azonosított (PRDM16, PAX3, TP63, C5orf50, és COL17A1) amelyek az arc morfológiáját egyértelműen befolyásolják, mások a szem-és hajszín kialakításában részt vevő allélok- at vizsgáltak Pl. a Pax3 alléljai a nasion hosszát határozzák meg Citation: Liu F, van der Lijn F, Schurmann C, Zhu G, Chakravarty MM, et al. (2012) A Genome-Wide Association Study Identifies Five Loci Influencing Facial Morphology in Europeans. PLoS Genet 8(9): e


Letölteni ppt "„az emberek hazudnak, de a bizonyítékok nem” Bizonyítékok típusai: -indirekt (pl. fotó) -direkt (pl. haj) -„hideg nyom” (textil) -„forró nyom” (DNS)"

Hasonló előadás


Google Hirdetések