Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

MŰSZERES ANALITIKAI KÉMIA ELVÁLASZTÁSTECHNIKA Vegyész szak 2007. I. félév Zsigrainé dr. Vasanits Anikó Zsigrainé dr. Vasanits Anikó.

Hasonló előadás


Az előadások a következő témára: "MŰSZERES ANALITIKAI KÉMIA ELVÁLASZTÁSTECHNIKA Vegyész szak 2007. I. félév Zsigrainé dr. Vasanits Anikó Zsigrainé dr. Vasanits Anikó."— Előadás másolata:

1 MŰSZERES ANALITIKAI KÉMIA ELVÁLASZTÁSTECHNIKA Vegyész szak I. félév Zsigrainé dr. Vasanits Anikó Zsigrainé dr. Vasanits Anikó

2 Követelmények II. éves vegyész BSc és III. éves vegyész „Műszeres analitika” tantárgyból Előadás: a „Tanulmányi és vizsgaszabályzat” szerint az előadásokon való részvétel nem kötelező, de ajánlott, hiszen a vizsgaanyaga döntően az előadások anyaga. Az első előadáson ismertetjük a féléves tematikát. Vizsgafeltétel: az „Az analitikai kémia” (kv1n1an1) előzetes teljesítése!!!! Vizsga: A hallgatók külön szóbeli vizsgát tesznek (egyazon vizsganapon) a „Spektroszkópia” és külön az „Elválasztástechnika” tananyagból, mely érdemjegyek átlagából kapják a végső jegyet. Valamelyik részvizsga elégtelenre való teljesítése esetén, a vizsgajegy elégtelennek számít. A sikertelen vizsga ismétlése a TVSZ előírásai szerint történik. Hármas, vagy annál jobb részvizsgát nem kell ismételni.

3 Irodalom Burger Kálmán: Az analitikai kémia alapjai: Kémiai és műszeres elemzés, Semmelweis kiadó 1999, vagy ALLITER , Burger Kálmán: Az analitikai kémia alapjai: Kémiai és műszeres elemzés, Semmelweis kiadó 1999, vagy ALLITER , Pokol György – Sztatisz Janisz: Analitikai kémia I fejezet Pokol György – Sztatisz Janisz: Analitikai kémia I fejezet Műegyetemi Kiadó, 1999 Műegyetemi Kiadó, 1999 Dr. Mádi Istvánné: Elválasztástechnika (KLTE) Dr. Mádi Istvánné: Elválasztástechnika (KLTE) Nemzeti tankönyvkiadó, 1993 Nemzeti tankönyvkiadó, 1993 Kremmer Tíbor, Torkos Kornél Kremmer Tíbor, Torkos Kornél Elválasztástechnikai módszerek elmélete és gyakorlata Elválasztástechnikai módszerek elmélete és gyakorlata Akadémiai Kiadó, 2010 Akadémiai Kiadó, 2010 Weboldalak Weboldalak

4 Weboldalak Animációk: 9D0D5B16BA0C1256E92003E865B?OpenDocument 9D0D5B16BA0C1256E92003E865B?OpenDocument 8C9E293F99BEC1256E92003E865A?OpenDocument 8C9E293F99BEC1256E92003E865A?OpenDocument D526B88731AC1256E92003E865C?OpenDocument D526B88731AC1256E92003E865C?OpenDocument 717F50A3605C1256E92003E865D?OpenDocument 717F50A3605C1256E92003E865D?OpenDocumentIONKROMATOGRÁFIA: AFFINITÁS KROMATOGRÁFIA:

5 GÁZKROMATOGRÁFIA: MS:

6 Elválasztástechnika KROMATOGRÁFIA: Speciális fizikai-kémiai, analitikai és preparatív elválasztási módszerek összessége, oldatban levő, vagy gázhalmazállapotú, sokkomponensű elegyek összetevőinek egymástól való elkülönítésére. Általános alapelv: Egy keverék komponenseinek két egymással nem elegyedő fázis (álló- és mozgófázis) közötti anyagátmenet, valamint az egyes alkotóknak az álló- és mozgófázissal való eltérő kölcsönhatása. Egy keverék komponenseinek két egymással nem elegyedő fázis (álló- és mozgófázis) közötti anyagátmenet, valamint az egyes alkotóknak az álló- és mozgófázissal való eltérő kölcsönhatása.

7 Álló- és mozgófázis Állófázis: Állófázis: - szilárd, - szilárd, - folyékony, de mindenképpen helyhez kötött. - folyékony, de mindenképpen helyhez kötött. Mozgófázis: Mozgófázis: - gáz  gázkromatográfia - gáz  gázkromatográfia - folyadék  folyadékkromatográfia - folyadék  folyadékkromatográfia - szuperkritikus folyadék  szuperkritikus fluid - szuperkritikus folyadék  szuperkritikus fluid kromatográfia kromatográfia A fázisok közötti anyagátmenet dinamikus jellegű. Minta „útja”: mozgó fázis  állófázis  új mozgó fázis új állófázis új állófázis

8 Kromatogram kialakulása

9 Csúcs elúciós profil K i = c i,s c i,m c i,m

10 Dinamikus egyensúly jön létre. Időegység alatt az állófázisba bejutott molekulák (atomok, ionok) száma = időegység alatt a mozgó- fázisba jutott részecskék száma (egy másik pontján a rendszernek). Speciális kölcsönhatások a minta és az állófázis között: a, Fizikai - adszorpció, - abszorpció (megoszlás). - abszorpció (megoszlás). b, Kémiai - másodlagos kötőerők, - sav-bázis kölcsönhatások. - sav-bázis kölcsönhatások. c, Biológiai - enzim-szubsztrát kapcsolat

11 Adszorpció Egy gáz, folyadék vagy szilárd réteg képződése egy szilárd anyag, vagy ritkábban egy folyadék felszínén. A létrehozó erők természetétől függően két típusát különböztetik meg. A kemiszorpció egyetlen réteget képez a molekulákból, atomokból vagy ionokból, amelyek az adszorbeáló felülethez kémiai kötéssel kapcsolódnak. A fiziszorpció esetén az adszorbeált molekulákat gyengébb, van der Waals erővel kötődnek. Egy gáz, folyadék vagy szilárd réteg képződése egy szilárd anyag, vagy ritkábban egy folyadék felszínén. A létrehozó erők természetétől függően két típusát különböztetik meg. A kemiszorpció egyetlen réteget képez a molekulákból, atomokból vagy ionokból, amelyek az adszorbeáló felülethez kémiai kötéssel kapcsolódnak. A fiziszorpció esetén az adszorbeált molekulákat gyengébb, van der Waals erővel kötődnek.

12 A kromatográfiás módszerek csoportosítása MÓDSZERKÖLCSÖNHATÁS AFFINITÁS MÉRTÉKE Adszorpciós kromatográfia Adszorpció Adszorpciós együttható Megoszlási kromatográfia Megoszlás (extrakció) Megoszlási állandó Ioncserés kromatográfia Elektrosztatikus (megoszlás) (megoszlás) Töltés, disszociációs állandó, ionátmérő Gélkromatográ- fia DiffúzióMolekulaméret Affinitás kromatográfia Biospecifikus (adszorpció) Nincs általános mérték (Michaelis állandó)

13 ADSZORPCIÓS KROMATOGRÁFIA Elválasztás alapja: Egy bizonyos fázisban oldott keverék egyes összetevői a másik fázis határfelületén koncentráció különbségeket mutatnak. Eltérő adszorpciós koefficiensek → koncentráció különbség a fázishatáron. Elrendezés: szilárd adszorbens  folyékony-, vagy gáz mozgófázis mozgófázis (oszlopban, síklapon) Az összetevők eltérő adszorpciója az adszorbens részecskék felületén → a komponensek a mozgófázissal fokozatosan távoznak, eluálódnak.

14 Adszorbeált anyag és adszorbens közötti kölcsönhatás  Koordinatív kötés  Másodlagos kötőerők (diszperziós, dipól-dipól és H-híd)  DE! Kemiszorpció- kovalens kötés kialakulása kerülendő

15 Adszorpciós egyensúly jellemzése az adszorpciós együtthatóval K A ~ c 2 állófázis K A ~ c 2 állófázis c 1 mozgófázis c 1 mozgófázis

16 Adszorbensek jellemzése 1. Megfelelő szemcseméret. 2. Szilárdság. 3. Nagy felület (≥100 m 2 /g). 4. Egyenletes pórusméret. 5. Egyenletes szemcsealak, lehetőleg szabályos gömböcskék. 6. Oldhatatlan legyen a mozgófázisban. 7. Indifferens legyen a mozgófázissal és az elválasz- tandó vegyületekkel szemben.

17  Adszorbens kapacitása: egységnyi tömeg által adszorbeált anyagmennyiség.  Adszorbens aktivitása: kötőképesség erőssége.  Adszorbens szelektivitása: egységnyi adszorbenstömegen legnagyobb mértékben adszorbeált komponens mennyisége a többi összetevőhöz képest.  Szervetlen adszorbensek: 1, Szilikagél – legáltalánosabban használt, Si-OH felületi csoportokkal, H-híd képzése az elválasztandó anyagokkal. Gyengén savas természetű – bázisos anyagok elválasztási nehézsége.

18 OOOO

19 Kloroform adszorpciós izotermája szilikagélen, heptán oldószerben 40 w/v%

20 Két-rétegű oldószer adszorpció – etil-acetát (B) heptánban (A)

21 Etil-acetát adszorpciós izotermája szilikagélen in Heptane

22 Két-rétegű oldószer adszorpció + minta Heptán(A)+4m/V% etil-acetát(B)+benzil-acetát(solute)

23 2, Aluminium-oxid – bázisos jellegű Felületi Al-OH- és Al-O - -hoz kapcsolódó H-híd képzése. Szerves adszorbensek: 1, Aktívszén Növényi és állati eredetű anyagok elszenesítési terméke (fa-, dióhéj-, csont-, vér- és cukorszén). Apoláros adszorbens → nagy móltömegű, szerves vegyületek kötődnek nagyobb mértékben (aromás-, kén-, bróm-, és jódtartalmú molekulák) diszperziós kölcsönhatások révén.

24 A mozgófázis jellemezése 1. A minta összetevőit eltérő mértékben oldja. 2. A minta összetevőivel és az állófázissal ne alakuljon ki irreverzibilis kölcsönhatás. 3. Viszkozitása csekély legyen. ELUOTRÓP SOROK ELUOTRÓP SOROK A mozgófázis elúciós készségét jellemezzük az alkalmazott rendszer függvényében (adszorbens és adszorbeált anyag). Az elúciós készség a dielektromos állandóval (ε) arányos. Sorrend: a, aluminium-oxidon (hidrofil adszorbens): hexán<

25 Kísérleti elrendezés

26 IONCSERÉS KROMATOGRÁFIA Az ioncserélők olyan szerves vagy szervetlen anyagok, amelyek poláris funkciós csoportjaik réven képesek kationjaikat vagy anionjaikat az oldatban lévőkkel kicse- rélni. Az ioncserélők általá- ban szilárd halmazállapotú anyagok, de lehetnek vízben nem oldódó folyadékok is. Az ioncserélők funkciós cso- portjai lehetnek savak (katex - kationcserélő) vagy bázisok (anex – anioncserélő).

27 Ioncserélők típusai 1. Ioncserélő gyanta - sztirol és divinil- benzol kopolimere Stabilak és nyomásállók. Stabilak és nyomásállók. Gömb alakú részecskék (emulziós poli- merizáció). Gömb alakú részecskék (emulziós poli- merizáció). Aromás gyűrűre viszik fel kémiai reakcióval a megfelelő ioncserélő sajátságú funkcióscsoportokat. Aromás gyűrűre viszik fel kémiai reakcióval a megfelelő ioncserélő sajátságú funkcióscsoportokat.

28 Ioncserélő gyanta - sztirol és divinil-benzol kopolimere

29 2. Dextránalapú ioncserélők DEAE-Sephadex (dextránra kötött dietil-amino- etil). DEAE-Sephadex (dextránra kötött dietil-amino- etil). CM-Sephadex (karboxi-metil csoport). CM-Sephadex (karboxi-metil csoport). Stabilak. Stabilak. Vízben és szerves oldószerekben oldhatatlanok. Vízben és szerves oldószerekben oldhatatlanok. 3. Szilikagél alapú ioncserélők a. Módosított szilikagél, (3‹pH‹7). b. Szerves polimerrel fedett szilikagél (üveggyöngy). Az 1. és 3.b fázisok azok, amelyek nyomás alatt alkalmazhatók, így kis szemcseátmérőjű töltettel töltött kolonnákban használhatók, azaz nagy hatékonysággal üzemeltethetők. Az 1. és 3.b fázisok azok, amelyek nyomás alatt alkalmazhatók, így kis szemcseátmérőjű töltettel töltött kolonnákban használhatók, azaz nagy hatékonysággal üzemeltethetők.

30 Módosított szilikagél

31 4. Aluminium-oxid alapú ioncserélők Amfoter jelleg!!! Amfoter jelleg!!! A hidrált alumínium-oxid anion és kationcserélő formája

32 Gyantához kötött funkciós csoportok KATEX típusú: Rgyanta-SO 3 H erősen savas Rgyanta-SO 3 H erősen savas Rgyanta-COOH közepesen savas Rgyanta-COOH közepesen savas Rgyanta-OH gyengén savas Rgyanta-OH gyengén savas ANEX típusú: Rgyanta-NR 3 OH erősen bázisos Rgyanta-NR 3 OH erősen bázisos Rgyanta-NH 3 OH közepesen bázisos Rgyanta-NH 3 OH közepesen bázisos Ioncserélő kapacitás: megkötött ellentétes töltésű ion mennyiség egységnyi tömegű tölteten (mmol/g vagy mekv./g).

33 Kationioncsere: Rgyanta-SO 3 H + Na +  Rgyanta-SO 3 Na + H + Rgyanta-SO 3 H + Na +  Rgyanta-SO 3 Na + H + Az oldatban lévő Na + ionok a ioncserélő gyantára kötődnek, miközben ekvivalens mennyiségű H + ionok kerülnek az oldatba. Eluensként híg, erős savakat használnak. Az oldatban lévő Na + ionok a ioncserélő gyantára kötődnek, miközben ekvivalens mennyiségű H + ionok kerülnek az oldatba. Eluensként híg, erős savakat használnak. Anioncsere: Rgyanta-N(CH 3 ) 3 OH + Cl -  Rgyanta- N(CH 3 ) 3 Cl + OH - Rgyanta-N(CH 3 ) 3 OH + Cl -  Rgyanta- N(CH 3 ) 3 Cl + OH - Vagyis a gyantára kötött OH - ionok szabadulnak fel. Eluensként bázisos oldatokat használnak. Vagyis a gyantára kötött OH - ionok szabadulnak fel. Eluensként bázisos oldatokat használnak.

34 Anioncserélők - jellemzőjük, hogy az állófázis felületén rögzített pozitív töltések találhatók az elválasztás körülményei között. Kationcserélők - jellemzőjük, hogy az állófázis felületén rögzített negatív töltések találhatók az elválasztás körülményei között. Erős anioncserélők azok, amelyek ioncserélő kapacitása független az eluens pH értékétől. Ilyenek a kvaterner-ammó- nium vegyületek (pl. trimetil-ammónium, Type I).

35 Gyenge anioncserélők, ezeknél a fázisoknál az ioncserélő kapacitása az eluens pH értékének függvénye. Ilyen csopor- tok a primer, a szekunder és tercier aminok.

36 Gyenge kationcserélők állófázis szerkezete és kapacitás függése a mozgó fázis pH értékétől

37 Ionok kötödésének erőssége függ:  Ionméret és fajlagos töltés.  Eluens jellemzőitől (víz, só, szerves oldószer elegye):  puffer ion-koncentrációja,  puffer pH-ja,  alkalmazott szerves módosítok (metanol, etanol, glicerin, butanol, acetonitril),  ellenion, mely a meghatározandó összetevővel verseng és ennek a folyamatnak az eredménye megszabja a visszatartást és a szelektivitást.

38 Anionok meghatározásakor többértékű gyenge savakat (pl. benzoesav, o-ftálsav, citromsav, borkősav) teszünk a mozgó fázisba, ezek ionos formái szolgáltatják az ellenionokat. Anionok meghatározásakor többértékű gyenge savakat (pl. benzoesav, o-ftálsav, citromsav, borkősav) teszünk a mozgó fázisba, ezek ionos formái szolgáltatják az ellenionokat. Az o-ftálsav ionizációjának és eluenserősségének függése a mozgó fázis pH értékétől eluenserősség, eluenserősség

39 Kationok elválasztásakor többértékű gyenge bázisokat (pl. etilén-diamin, 2-metil-piridin) teszünk a mozgó fázisba, ezek ionos formái szolgáltatják az ellenionokat. A visszatartást megszabó folyamatok komplexképzőt és szerves bázist tartalmazó mozgó fázis alkalmazásakor

40 DETEKTÁLÁSI MÓDSZEREK  Az ionkromatográfiában fő detektálási módszer a mozgó fázis vezetésének figyelése, mérése. Az egykolonnás ionkro- matográfiában ez egy átfolyó mérőteres vezetőképességi cellát jelent. Meghatározások 95%-ában. 5 ppb – 5 ug/L kimutatási határ.  Ion folyadékkromatográfiában csak néhány ionnak van az UV, vagy a látható fénytartományban fényelnyelése. Ezek például a jodid, nitrit, nitrát, jodát, kromát, permanganát.  A kationok meghatározásánál használhatunk kolonna utáni (post column reaction) vagy kolonna előtti (precolumn reaction) származékképzést, s így színes komplexeket kapunk.

41 Két kolonnás ionkromatográfia

42 Ion elnyomás (supressed ion chromatography) ioncserés oszloppal – két kolonnás módszer cél: a mozgófázis vezetőképességének csökkentése a detektálás előtt Klorid ion mérése Az ionelnyomóban (erős kation cserélő oszlop H formában) lejátszódó folyamatok, ha az eluens puffere NaHCO 3, vagy Na 2 CO 3 : Gyanta-SO 3 - H + + Na + → Gyanta SO 3 - -Na + + H + H + + HCO 3 - → H 2 CO 3 H + + HCO 3 - → H 2 CO 3 H + + Cl - → HCl H + + Cl - → HCl A mozgófázis vezetőképessége csökken (Na + → H 2 CO 3 ). Az elválasztott ion vezetőképessége megnő (NaCl → HCl).

43 2. Kationok elválasztása anioncserélő gyantaoszlopon (Varion AB) Fémionok klorokomplexeinek elválasztása klorid- formájú anioncserélő oszlopon. Fémionok klorokomplexeinek elválasztása klorid- formájú anioncserélő oszlopon. Ni 2+ klorokomplexe [NiCl] + → oszlopon nem kötődik Ni 2+ klorokomplexe [NiCl] + → oszlopon nem kötődik Co 2+ [CoCl 4 ] 2- stabil-klorokomplex → oszlopon kötődik Co 2+ [CoCl 4 ] 2- stabil-klorokomplex → oszlopon kötődik Klorid koncentráció növelésével eluálható az oszlopról. Klorid koncentráció növelésével eluálható az oszlopról. 3. Vízanalitikában a főbb ionok, különösen az anionok klorid, szulfát, stb. mérésére. !!!! 4. Vízlágyítás: Ca 2+ és Mg 2+ ionok Na + -ra cserélése. 5. Hidrofil szerves anyagok elválasztása

44 5. Automatikus aminosav analizátor Erősen savas kationcserélő gyantán történik az amino- savak elválasztása. Erősen savas kationcserélő gyantán történik az amino- savak elválasztása.  Az aminosavak kötődését nagyon sok tényező befolyásolja, alapvető szerepe a pH-nak és az ellenion koncentrációnak van. Alacsony pH-n az aminosavak kationként viselkednek. A pH növelésével egyre kevésbé, az izoelektromos pont elérésekor és magasabb pH-n egyáltalán nem kötődnek a gyantához.

45 Az aminosavakat erősen savas oldatban visszük fel az oszlopra, hogy a megkötődés azonnal bekövetkezzék. Az elúcióhoz pH 3-10 közötti pufferek széles skálája használa- tos. Az elúció leggyakrabban lépcsős gradiens elúció, azaz 3- 4, fokozatosan növekvő pH-jú és ellenion koncentrációjú pufferrel történik az elválasztás. Az aminosavakat erősen savas oldatban visszük fel az oszlopra, hogy a megkötődés azonnal bekövetkezzék. Az elúcióhoz pH 3-10 közötti pufferek széles skálája használa- tos. Az elúció leggyakrabban lépcsős gradiens elúció, azaz 3- 4, fokozatosan növekvő pH-jú és ellenion koncentrációjú pufferrel történik az elválasztás. Az oszlopról távozó eluátumban az aminosavak mennyiségét általában ninhidrines színreakcióval határoz- zák meg. A fotometrálás átfolyó küvettás detektorban tör- ténik. Az aminosavak többsége (a primer aminok) a ninhidrinnel liláskék színreakciót ad ami 570 nm-en fotometrálható. A szekunder aminok (prolin, hidroxi- prolin) a ninhidrinnel sárga színű terméket képeznek, ami 440 nm-en mérhető. Az oszlopról távozó eluátumban az aminosavak mennyiségét általában ninhidrines színreakcióval határoz- zák meg. A fotometrálás átfolyó küvettás detektorban tör- ténik. Az aminosavak többsége (a primer aminok) a ninhidrinnel liláskék színreakciót ad ami 570 nm-en fotometrálható. A szekunder aminok (prolin, hidroxi- prolin) a ninhidrinnel sárga színű terméket képeznek, ami 440 nm-en mérhető.

46 Aminosavak reakciója ninhidrinnel

47 Ionkizárásos folyadékkromatográfia

48 Gyanta: nagy ioncserélő kapacitású kationcserélő. Gyanta: nagy ioncserélő kapacitású kationcserélő. Elválasztás alapja: alkoholok, szénhidrátok és szerves savak disszociálatlan formában be diffundálnak a pórusokba – hidrofób kölcsönhatás, H-híd a protonált ioncserélő csoportokkal. Elválasztás alapja: alkoholok, szénhidrátok és szerves savak disszociálatlan formában be diffundálnak a pórusokba – hidrofób kölcsönhatás, H-híd a protonált ioncserélő csoportokkal. Mozgófázis: 0,01 – 0,001 M kénsav, vagy salétromsav, esetenként v/v% acetonitril. Mozgófázis: 0,01 – 0,001 M kénsav, vagy salétromsav, esetenként v/v% acetonitril.

49 GÉLKROMATOGRÁFIA  Szinonim elnevezések: gélszűrés, molekulaszűrés, méretkizárásos kromatog- ráfia, géláthatolási kroma- tográfia. gélszűrés, molekulaszűrés, méretkizárásos kromatog- ráfia, géláthatolási kroma- tográfia.  Egyike a legfontosabb biokémiai eljárásoknak.  Elsősorban biológiai mak- romolekulák tisztítására alkalmazzák. 30 éve alkal- mazott technika.  Fordított szűrő!

50 Gélképző anyagok 1. Természetes gélképző anyagok Agaróz: D-galaktóz és 3,6-anhidro-L-galaktóz egységekből felépített lineáris poliszacharid. → Sepharose 2. Félszintetikus gélképző anyagok Dextrán: glükózegységekből 1,6-α-glükozid kötésekkel felépített lineáris poliszacharid, kevés oldallánccal. → Sephadex A nyers dextrán részleges hidrolizsével nyert dextránfrakciók lúgos oldatához epiklórhidrint (CH 2 -CH-CH 2 -Cl) adnak. „Végtermék”: O „Végtermék”: O Dextrán-O-CH 2 -CHOH-CH 2 -O-dextrán A keresztkötések számával csökken a gélek pórusmérete és annak a molekulaméretnek a határértéke, amely a gél szerkezetébe még éppen behatolhat.

51 3. Szintetikus gélképző anyagok Akrilamid-akrilát kopolimerek: akrilamid és a N,N’-metilén- bisz-akrilamid kopolimerizációjával állítják elő. A pórusméretet elsősorban az akrilamid koncentrációja, másodsorban a keresztkötéseket létrehozó N,N’-metilén- bisz-akrilamid aránya határozza meg. Kereskedelmi forgalomban a Bio-Gel P típusok vannak. Előnyük, hogy a szemcsék ridegebbek, mechanikai hatá- soknak ellenállóbbak, valamint a bakteriális hatások iránt közömbösek. Előnyük, hogy a szemcsék ridegebbek, mechanikai hatá- soknak ellenállóbbak, valamint a bakteriális hatások iránt közömbösek.

52

53 A GÉLKROMATOGRÁFIA ALKALMAZÁSI TERÜLETEI 1. Makromolekulák sómenetesítése 2. Puffercsere Minta előkészítése pufferváltással ioncseréhez, vagy affinitás kromatográfiához. Minta előkészítése pufferváltással ioncseréhez, vagy affinitás kromatográfiához. 3. Reakciók lezárása makromolekulák és alacsony molekulatömegű reagensek között. 4. Frakcionálás Hasonló molekulaméretű anyagok elválasztása → gél (megfelelő frakcionálási tartomány) helyes megválasztása elsődleges. Hasonló molekulaméretű anyagok elválasztása → gél (megfelelő frakcionálási tartomány) helyes megválasztása elsődleges. 5. Polimerek móltömeg eloszlása 6. Molekulatömeg meghatározás – ismert tömegű fehérje standard oldatokkal kalibráció.

54 Makromolekulák sómenetesítése A 570 nm Vezetőképesség (μS Vezetőképesség (μS)

55 V 0 = szemcsék közötti térfogat V i = pórustérfogat Lg M teljes kizárásiM teljes kizárási M teljes áteresztésiM teljes áteresztési M mérési tömeg V (ml)

56 Polimerek elválasztása

57 AFFINITÁS KROMATOGRÁFIA Az affinitás kromatográfia olyan típusú adszorpciós kromatográfiás eljárás, amelyben a tisztítandó anyag specifikusan és reverzibilisen adszorbeálódik a ligandhoz, amely egy oldhatatlan anyagon (mátrix) van rögzítve. Az affinitás kromatográfia olyan típusú adszorpciós kromatográfiás eljárás, amelyben a tisztítandó anyag specifikusan és reverzibilisen adszorbeálódik a ligandhoz, amely egy oldhatatlan anyagon (mátrix) van rögzítve. 20 éve alkalmazott technika. 20 éve alkalmazott technika. Koncentráló hatású. Koncentráló hatású. Nagyfokú szelektivitás jellemzi. Nagyfokú szelektivitás jellemzi.

58 ALKALMAZÁSA 1.Anyagok tisztítására (enzim, antitest) komplex biológiai elegyekből. 2.Ugyanazon anyag natív formájának elválasztására a denaturált anyagtól. 3.Receptorok, enzimek, DNS fragmensek izolálása. 4.Az ipari biotechnológiai alkalmazásokban monoklonális antitestek gyártása.

59 Mátrix tulajdonságai: Oldhatatlan az alkalmazandó pufferekben és oldószerekben. Oldhatatlan az alkalmazandó pufferekben és oldószerekben. Mechanikailag és kémiailag stabil, jó átfolyási tulajdonságokkal. Mechanikailag és kémiailag stabil, jó átfolyási tulajdonságokkal. Könnyen kapcsolható a ligandhoz. Könnyen kapcsolható a ligandhoz. Ligand tulajdonságai: Specifikus és reverzibilis kötődési affinitással kell rendelkeznie a tisztítandó anyaghoz. Specifikus és reverzibilis kötődési affinitással kell rendelkeznie a tisztítandó anyaghoz. Megfelelő kémiai csoportokkal kell rendelkeznie a mátrixhoz való kötödés érdekében. Megfelelő kémiai csoportokkal kell rendelkeznie a mátrixhoz való kötödés érdekében.

60 Mátrix fajták 1. Agaróz D-galaktóz és 3,6-anhidro-L-galaktóz egységekből felépített lineáris poliszacharid. → Sepharose (lsd. gélkromatográfia) D-galaktóz és 3,6-anhidro-L-galaktóz egységekből felépített lineáris poliszacharid. → Sepharose (lsd. gélkromatográfia)

61 2. Poliakrilamid (lsd. gélkromatográfia) A poliakrilamid-gyöngyök szintetikus akrilamid poli- merek, melyeket bisz-akrilamidos keresztkötésekkel megfelelően szilárd mátrixanyaggá alakítanak. A poliakrilamid-gyöngyök szintetikus akrilamid poli- merek, melyeket bisz-akrilamidos keresztkötésekkel megfelelően szilárd mátrixanyaggá alakítanak. Hátránya: Hátránya: - mechanikailag kevésbé stabil; - mechanikailag kevésbé stabil; - erősen tapad az üvegfelületekhez. - erősen tapad az üvegfelületekhez. 3. Szabályozott pórusú üveg Legáltalánosabban alkalmazott szervetlen mátrix. Legáltalánosabban alkalmazott szervetlen mátrix. Előnye: nagy mechanikai stabilitása. Előnye: nagy mechanikai stabilitása. Használat: enzimek immobilizálása, melyeket biokatalizátorként alkalmaznak a biotechnológiai folyamatokban. Használat: enzimek immobilizálása, melyeket biokatalizátorként alkalmaznak a biotechnológiai folyamatokban.

62

63 Az affinitáskromatográfiás elválasztás lépései: Az affinitáskromatográfiás elválasztás lépései: 1, A tisztítandó anyag megkötése. 1, A tisztítandó anyag megkötése. Kialakuló kölcsönhatások: Kialakuló kölcsönhatások: - elektrosztatikus; - elektrosztatikus; - hidrofób; - hidrofób; - hidrogénhídkötések. - hidrogénhídkötések. Minta oldása megfelelő felvivő pufferben. Minta oldása megfelelő felvivő pufferben. 2, A nem kötődött anyagok kimosása (10 oszloptérfogat pufferrel). 2, A nem kötődött anyagok kimosása (10 oszloptérfogat pufferrel). 3, Elució – kölcsönhatások megszüntetése 3, Elució – kölcsönhatások megszüntetése 1, Szelektív elució: biospecifikus elució, melyben az eluálószer a, vetélkedik a liganddal a szelektíven kötött anyagért (leoldás) a, vetélkedik a liganddal a szelektíven kötött anyagért (leoldás) b, vetélkedik a megkötött anyaggal a ligandért (leszorítás) b, vetélkedik a megkötött anyaggal a ligandért (leszorítás)

64 a, Elution of NADP dependent enzymes from Blue Sepharose by adding NADPH b, Elution of HIS tagged proteins from HiTrap Chelating by adding imidazole.

65 2, Nem szelektív elució, sokszor denaturálódást jelent: a, pH változtatása megvál- toztatja a töltéssel rendelkező csoportok ionizáltsági fokát a kötő helyeken → deszorpció a, pH változtatása megvál- toztatja a töltéssel rendelkező csoportok ionizáltsági fokát a kötő helyeken → deszorpció b, ionerősség változtatása növekvő ionerősségű puffer használatával → ( pl. NaCl, 1 mólos végkoncentrációban). b, ionerősség változtatása növekvő ionerősségű puffer használatával → ( pl. NaCl, 1 mólos végkoncentrációban).

66 Alkalmazás Fenil boronát affinitás kromatográfia - 1,2 és 1,3 cisz-diol csoportot tartalmazó cukrok kőtödnek hozzá – borsav- komplexek Lúgos közegben stabil – savval, szorbittal megbontható

67 Fetuin elválasztása


Letölteni ppt "MŰSZERES ANALITIKAI KÉMIA ELVÁLASZTÁSTECHNIKA Vegyész szak 2007. I. félév Zsigrainé dr. Vasanits Anikó Zsigrainé dr. Vasanits Anikó."

Hasonló előadás


Google Hirdetések