A kromatográfia alapjai Olyan elválasztási módszer, amelynél a vizsgálandó minta alkotóinak elválasztása egy helyhez kötött állófázis és az ezzel érintkező, mozgó fluid fázis közötti anyagátmeneten, valamint az egyes alkotóknak az álló fázissal való eltérő kölcsönhatásán alapszik. Előzmények 1906: M. Cvet (1872-1919), orosz botanikus - levél színanyagainak elválasztása CaCO3 állófázison. Kromatográfia. (Adszorpciós oszlop kromatográfia) 1938-ig: Mikro-kromatográfia: Kísérletek az oszlopátmérő lecsökkentésére (1mm-ig). Probléma: oszlop előállítása (töltése), nagyon kis anyagmennyiség vizsgálata. 1937: vékonyréteg kromatográfia elve. A zárt (oszlop) helyett nyitott (vékonyrétegű) állófázis alkalmazása. (Ismailov és Shraiber) 1940/50: Archer és Synge: A megoszlásos kromatográfia alapelvei-> folyadékkromatográfia

A kromatográfia alapjai A kromatográfiás elválasztás lehetőségei: - frontális - kiszorításos - elúciós elválasztás Gyakorlati alkalmazás szintjén a manapság alkalmazott eljárások leginkább az elúciós kromatográfiás eljárások. Elúciós kromatográfia: a mintát az állófázisra (oszlop vagy réteg) juttatjuk és onnan egy eluenssel (mozgó fázis) folyamatosan „lemossuk”, eltávolítjuk. Az egyes komponensek az álló és mozgófázis közötti eltérő megoszlásuk miatt különböző sebességgel vándorolnak végig az állófázison.. -> kémiai megoszlás jelensége

A kromatográfia alapjai Mozgófázis áramlása Szelektivitás Az elúció során végbemenő megoszlás elve. K:megoszlási hányados Cs: koncentráció az állófázisban, Cm: koncentráció a mozgófázisban

A kromatográfiás módszerek csoportosítása

A kromatográfia alapjai A molekulatömeg és a kromatográfiás módszerek kapcsolata Az elúciós elválasztás elve

Kromatográfiás módszerek csoportosítása A kromatográfiás ágy alakja szerint: Síkkromatográfia: 1. Vékonyréteg kromatográfia (állófázis: vékonyréteg (0.2 mm vastag réteglap), mozgófázis: folyadék. Nem illékony vegyületek elválasztása) 2. Papírkromatográfia (állófázis: cellulóz, mozgófázis: folyadék. Nem illékony vegyületek elválasztása. elavult..) Oszlopkromatográfia 1. Folyadékkromatográfia. (állófázis: töltött oszlop, mozgófázis: folyadék. Nem illékony vegyületek elválasztása.) 2. Gázkromatográfia. (állófázis: töltött oszlop, mozgófázis: gáz. Illékony vegyületek elválasztása.) A mozgófázis halmazállapota szerint: 1. Gázkromatográfia (..) 2. Folyadékkromatográfia (..) 3. Szuperkritikus folyadékkromatográfia (mozgófázis: kritikus állapotú folyadék) Az elválasztás mechanizmusa szerint: 1. Ioncserés kromatográfia (állófázis: ioncserélő gyanta) 2. Méretkizárásos kromatográfia (állófázis: porózus gél. Polimerek elválasztása.) 3. Affinitáskromatográfia (biológiai kölcsönhatáson (pl. antigén/antitest, enzim/szubsztrát, receptor/lignadum) alapuló kromatográfiás rendszer)

A vékonyréteg kromatográfia 1944: Consden, Gordon, Martin: Aminosavak elválasztása szűrőpapír vékonyrétegen (papírkromatográfia). Megoszlásos kromatográfia. Nagy népszerűség. Hátrányai: állófázis poláros, összetétele nem állandó. Csak egyes anyagcsoportok elválasztása. Nehezen reprodukálható elválasztás, kis felbontású. Nem standardizálható. 1958: Vékonyréteg kromatográfia. Előnyei: - Könnyen standardizálható (réteg vastagsága, szemcsemérete, előállítás, kifejlesztő kamra, stb.) - Segédeszközök alkalmazása (mintafelvitelhez, kiértékeléshez, stb..) - Sokoldalúan használható pontosan ismert összetételű szorbensek (állófázis) kifejlesztése (Al2O3, szilikagél (SiO2) , módosított szilikagél, stb.). - Alkamazási területek kiterjesztése 1962: E. Stahl: A modern vékonyréteg kromatográfia alapjai.

Vékonyréteg kromatográfia A vékonyréteg kromatográfiás analízis paraméterei: - Állófázis - Mintafelvitel - Kifejlesztés - Megjelenítés - Minőségi azonosítás - Mennyiségi kiértékelés

Vékonyréteg kromatográfia Állófázis Anyaga: 1. szilikagél (SiO2). Olcsó, hatékony, könnyen előállítható. 10-ből 9 rétegkromatográfiás elválasztás szilikagél állófázison történik. Szemcseméret: 5-15 μm (HPLC töltet: 1.5-5 μm). 2. módosított szilikagél (CN, NH2, C18, C8). Nem olcsó. Speciális alkalmazásokhoz. Vastagsága: 0.1 - 0.2 mm Hordozó: Alumíniumlemez vagy üveglap. Elméleti Elméleti tányérszám tányérmagasság VRK 2000 12 μm HPLC 15000 0.1-0.2 μm A HPLC és a VRK maximális elválasztóképessége 10 cm-es elválasztási távolságon. Hátrány: alacsony felbontás és elméleti tányérszám. Csak kis számú komponens választható el megfelelő elbontással.

Vékonyréteg kromatográfia Mintafelvitel Módja: pontszerű vagy sávszerű mintafelvitel. Mennyisége: feladatnak megfelelően megválasztható (2 pg – 1 mg). Pont- és sávszerű mintafelvitel Kifejlesztés után Előny: - Nincs szükség a minta koncentrálására, ha nem elég tömény. - Egy réteglapra akár 20 minta is felvihető. Egyszerre több minta meghatározható. Kisebb időigény. - Mintafelvitel hossza a feladatnak megfelelően meghatározható (akár 15 cm is lehet)

Vékonyréteg kromatográfia Kifejlesztés - Dinamikus fázisérintkeztetés. A mozgófázis áramlása a kapilláris erők következtében történik. A fázisérintkeztetés nem-egyensúlyi! - Horizontális és felszálló kifejlesztés. A gőztér jelenléte befolyásolja az elválasztás hatékonyságát. Felszálló kifejlesztés Horizontális kifejlesztés 1. Mozgófázis párolgása a kamra gőzterébe. 2. Lepárolgás a rétegről 3. Mozgófázis gőzinek adszorpciója a rétegre. 4. Mozgófázis megoszlása az állófázison (α, β, γ frontok) Állófázis Mozgófázis - A mozgófázis áramlása időben nem egyenletes (lassul). - A gőztér jelenléte befolyásolja az elválasztást. - A mozgófázis ha több komponensű önmaga is megoszlik az állófázison - Nehezen leírható.

Vékonyréteg kromatográfia Megjelenítés A vizsgált komponensek láthatók (pl. festékelegy). A legtöbb komponens azonban nem színes. Ezek megjelenítésére a szilikagél állófázis néhány százalékban tartalmaz ZnSiO3-t (cink-szilikát), amely 254 nm-es UV fénnyel megvilágítva fluoreszkál. A komponensek elfedik a réteget és sötét foltként láthatók. Több vegyület 366 nm-es UV fénnyel megvilágítva önmaga is fluoreszkál. 1 2 3 4 5 Látható fény UV (254 nm) UV (366 nm) Stephania kivonat elválasztása szilikagél állófázison. Megjelenítés különböző hullámhosszakon.

Vékonyréteg kromatográfia Megjelenítés Az esetek többségében azonban a vizsgált komponensek nem láthatók (nem színesek) illetve nem különíthetők el azonnal a többi anyagtól (mátrixtól). ? ? ? Szelektív megjelenítés származékképzéssel: A kifejlesztett réteg lefújása vagy bemerítése olyan anyaggal amely csak a vizsgálni kívánt komponensekkel képez lehetőleg színes vagy fluoreszkáló terméket.

Vékonyréteg kromatográfia Megjelenítés Szelektív megjelenítés származékképzéssel (előhívással) Előny: - Szelektív megjelenítés, csak a vizsgált vegyületcsoportra. - A mátrix, ill. nem vizsgált komponensek láthatatlanok maradnak. Nem szükséges a minta előkészítés során a mintát megtisztítani a mátrix- és egyéb zavaró komponensektől. - Nem jelent gondot az állófázis „elszennyezése”. Azofestékek bomlása során keletkező karcinogén aminok kimutatása festett bőranyagból. Előhívás: N-(1-naftil-)-etiléndiammónium-dikloriddal.

Vékonyréteg kromatográfia Megjelenítés Szelektív megjelenítés származékképzéssel Előny: Többszöri előhívás, illetve többszöri kiértékelés lehetősége. Astragalus és Hedysarum fajok vizsgálata

Astragalus és Hedysarum fajok vizsgálata 8 – Astragalus minta. Teljes gyökér. 9 – asztragalozid IV 10 – Astragalus gyökér, 2 éves 11 – Astragalus gyökér, 4 éves 12 – Astragalus gyökér, 6 éves 13 – Astragalus gyökér 14 – Astragalus gyökér, föld alatti szár 15 – Astragalus gyökér szelet (kinai) 16 – asztragalozid IV A – előhívás nélkül, 254 nm B – előhívás nélkül, 366 nm C – előhívás metanolos kénsavval, látható fény D – előhívás metanolos kénsavval majd 366 nm 1 – asztragalozid IV (szaponin típusú vegyület) 2-6 – Astragalus fajok 7- Hedysarum kivonat

Vékonyréteg kromatográfia Minőségi azonosítás Retenciós faktor (Rf) ÉS - Szín vagy egyéb optikai információ összevetése (pl. fluoreszcencia, reflexiós spektrum, stb.) alapján. front a b start A retenciós faktor értékének kiszámítása adott kromatográfiás sávra

Vékonyréteg kromatográfia Mennyiségi elemzés - Mennyiségi információ: a foltok mérete és optikai sűrűsége (színintenzitás) alapján. Denzitometria: a kromatográfiás foltok optikai sűrűségének mérése 1. Pásztázó denzitometria (diffúz-reflexiós spektrofotometria). 2. Videodenzitometria (digitális képalkotás a rétegről).

Vékonyréteg kromatográfia Pásztázó denzitometria Pásztázás optikai réssel, a diffúz módon visszavert fénymennyiség mérése. s1 m1 s2 m1 s3 m1 s4 m1 s5 denzitogram m1 – minta s1-s5 – standard

Vékonyréteg kromatográfia Pásztázó denzitometria Kalibrációs egyenes felvétele adott komponensre. Ismeretlen mintából az adott komponens mennyiségének meghatározása. - Kalibráció csúcsterület vagy csúcsmagasság alapján. csúcsterület s5 a s4 s3 s2 s1 anyagmennyiség (ng) s1 m1 s2 m1 s3 m1 s4 m1 s5 Kalibrációs egyenes a komponensre A komponens elválasztása m1 mintából és mennyiségének meghatározása ötpontos kalibráció segítségével.

Vékonyréteg kromatográfia Pásztázó denzitométer felépítése Denzitométer Denzitogram kiértékelése Pásztázó denzitométer felépítése

Vékonyréteg kromatográfia Videodenzitometria - Digitális képalkotás az előhívott réteglapról megfelelő megvilágítás (254 nm, 366 nm, látható fény) alkalmazásával. Nagy linearitású digitális kamera. Kép szoftveres kiértékelése. Rosszabb a mérési reprodukálhatósága mint a pásztázó denzitométernek, viszont gyorsabb és rugalmasabb annál. Képalkotás és kiértékelés Képalkotó rendszer

Vékonyréteg kromatográfia Denzitometria Egy réteglap többször is kiértékelhető (pl. több hullámhosszon vagy más megvilágítás mellett. Külön kiértékelési lehetőség előhívás előtt és után. UV-VIS reflexiós spektrum felvételének lehetősége a pásztázó denzitométerrel.

Vékonyréteg kromatográfia Vékonyréteg kromatográfia alkalmazása (+)-katechin meghatározása kocsányos tölgy kérgéből Külső kéreg (KK) KK BK KK BK KK BK Belső kéreg (BK) Szíjács C EC A kocsányos tölgy kérge Katechinek elválasztása tölgy kéregből. Állófázis: szilikagél, mozgófázis 9:1 diizopropil-éter.hangyasav. Előhívás vanillin-H3PO4 reagenssel. C: (+)-katechin EC: (-)-epikatechin Kalibrációs görbe (+)-katechinre

Vékonyréteg kromatográfia Túlnyomásos rétegkromatográfia (OPLC) Hagyományos VRK hátrányai: alacsony elméleti tényérszám, gőzfázis okozta reprodukálhatósági problémák; rövid kifejlesztési táv (6-10 cm); időben változó és nem optimális áramlási sebesség; lassú elválasztás (20 perc/ 6 cm) Az OPLC előnyei: Zárt állófázison történik a szétválasztás. Nincs gőztér. A mozgófázis (a HPLC-hez hasonlóan) kényszeráramlással mozog. Állandó és optimális áramlási sebesség. Nagy kifejlesztési távolság (akár 20 cm). Gyors elválasztás. (10 perc/20 cm) - Alacsony oldószerigény Az OPLC hátrányai: - Speciálisan előkészített réteglapot igényel, ami drágább.

Vékonyréteg kromatográfia Túlnyomásos rétegkromatográfia (OPLC) Mozgófázis frontja (mm) 20 cm Kifejlesztési idő (s) 1 – telített gőzterű felszálló kamra 2 - telítetlen gőzterű felszálló kamra 3 - OPLC Festékelegy OPLC elválasztása

Vékonyréteg kromatográfia Túlnyomásos rétegkromatográf (OPLC) OPLC - túlnyomásos rétegkromatográf

Vékonyréteg kromatográfia Túlnyomásos rétegkromatográfia alkalmazása Szénhidrátok minőségi és mennyiségi meghatározása sörmintából. xilóz fruktóz glükóz szacharóz - Párnanyomás: 50 bar. Mozgófázis: 9:1 acetonitril:víz Kifejlesztés 250 μl/perc 2 x 4500 μl mozgófázis Megjelenítés: anilin-difenilamin reagenssel. Kiértékelés: 540 nm-en (látható tartomány) maltóz s1 s2 s3 s4 s1 s2 s3 s4 s1 s2 s3 s4 Szénhidrátok elválasztása sörmintából

Vékonyréteg kromatográfia Túlnyomásos rétegkromatográfia alkalmazása Szénhidrátok elválasztása és azonosítása termikusan módosított faanyagból. Hőkezeléssel módosított faanyag megjelenítés: naftorezorcin reagenssel anilin-difenilamin reagenssel Szénhidrátok elválasztása hőkezeléssel módosított faanyagból Kromatogárfiás körülmények: árnanyomás: 50 bar; Mozgófázis: 9:1 acetonitril:víz; Kifejlesztés 250 μl/perc; 2 x 4500 μl mozgófázis; Előhívás naftorezorcin reagenssel, vagy anilin-difenilamin reagenssel.

Folyadékkromatográfia A folyadékkromatográfiás analízis paraméterei: - Állófázis - Mozgófázis - Elúció - Detektálás (analitikai jel) - Minőségi azonosítás - Mennyiségi kiértékelés

Folyadékkromatográfia Állófázis Anyaga: 1. szilikagél (SiO2). Olcsó, hatékony, könnyen előállítható. Gyakorlatban ritkán alkalmazzák, mivel az elúcióhoz szerves oldószerek szükségesek – nagyon költséges! Szemcseméret: 1.5-5 μm. 2. módosított szilikagél (-CN, -NH2, -C18, -C8). Az elúció vizes oldatokkal történik – költséghatékonyabb mint a szilikagél állófázis. Elméleti Elméleti tányérszám* tányérmagasság VRK 2000 12 μm HPLC 15000 0.1-0.2 μm A HPLC és a VRK maximális elválasztóképessége 10 cm-es elválasztási távolságon. Előny: nagy felbontás és elméleti tányérszám. Nagy számú komponens választható el megfelelő elbontással. * Egyensúlyi egységek száma adott mértű állófázison

Folyadékkromatográfia Mozgófázis: A, Ha az állófázis normálfázisú (poláros, pl. SiO2): etil-acetát, hangyasav, furán, diklórmetán, stb. (apoláros szerves oldószer). B, Ha az állófázis fordított fázisú (apoláros, pl. -C18, -C8, stb.): víz, metanol, acetonitril, stb. (poláros oldószer).

Folyadékkromatográfia A szilikagél felületi módosítása

Folyadékkromatográfia A HPLC módszerek osztályozása

Folyadékkromatográfia Elúció: Mozgófázis áramoltatása a szorbenságyon (állófázison) keresztül történhet: - Nehézségi erők hatására (hagyományos oszlopkromatográfia. Lassú, rossz felbontású, alacsony elméleti tányérszám). - Flash kromatográfia (Still, 1978): mozgófázis átvitele az oszlopon nyomás hatására. Gyorsabb, hatékonyabb. - HPLC: nagy nyomású/hatékonyságú folyadékkromatográfia. Nagy nyomás, ideális áramlási és elválasztási körülmények (ld. van Deemter-egyenlet) HPLC (High Performance Liquid Chromatography) Izokratikus és gradiens elúció (állandó összetételű, illetve változtatott összetételű mozgófázis alkalmazása).

Folyadékkromatográfia Elúció: A van Deemter egyenlet 2 3 1 H: elméleti tányérmagasság A: örvénydiffúzió B: hosszirányú diffúzió C: komponens átadás az álló- és a mozgófázis között u: lineáris áramlási sebesség Ideális sebesség Mozgófázis sebessége u (cm/sec) Ideális áramlási sebesség 1: 2, 3:

Folyadékkromatográfia A kromatográfiás elválasztás analitikai jellemzése

Folyadékkromatográfia Detektálás: Analitikai jel érzékelése. Az oszlopról távozó mozgófázisban oldott komponensek észlelése azok valamely specifikus tulajdonsága alapján ún. „átfolyó cellás” detektorban. Nem destruktív detektálás Törésmutató változás (pl. szénhidrátok) Fényabszorpció (UV, VIS, legtöbb szerves vegyületre alkalmazható) Vezetőképesség mérése Fluoreszcencia … alapján Destruktív érzékelés (komponensek szabályozott átalakítása, roncsolása) Oszlop után vagy előtt történő on-line vagy off-line származékképzés MS-dektektálás (ionizáció, fragmentáció, majd tömegszelektív detektálás)

Folyadékkromatográfia Egy HPLC rendszer felépítése A: mozgófázis tartályok; B: keverő szelep és gradienspumpa; C: Túlnyomás szabályozó; D: pulzáláscsökkentő; E: keverőkamra; F: mintabemérő szelep; G: kromatográfiás oszlop (állófázissal töltve); H. vezérlőegység; I: detektor (pl. UV fotométer); J: számítógép interfész (A/D konverter); K: számítógép; L: nyomtató

Folyadékkromatográfia Egy modern HPLC rendszer felépítése HPLC MS

Folyadékkromatográfia Minőségi analitikai információk: - Retenció: az állófázis azon tulajdonsága, hogy az alkotóval való kölcsönhatása révén a komponens előrehaladását késlelteti az inert eluenshez képest. - Bruttó retenciós idő (tR) - Redukált bruttó retenciós idő (t’R) t’R=tR - t0 független a geometriától, függ az áramlási sebességtől, állófázis tömegétől, a hőmérséklettől to: holtidő. Az az idő amely alatt a visszatartással nem rendelkező komponens a rendszeren végigér. V0: holttérfogat. A kromatográfiás rendszer (állófázis pórusai közti tér, vezetékek, stb.) térfogatának összege. F: térfogati áramlási sebesség (ml/min)

Folyadékkromatográfia Minőségi azonosítás: A kromatográfiás csúcs retenciós ideje (tR) alapján (szükséges feltétel, de nem elégséges) - Azonosság megerősítése: Spektrális tulajdonság alapján (UV-VIS abszorpciós spektrum) Molekulatömeg alapján, fragmentáció alapján, stb. detektorjel standard tR ? ? ? minta ? tR

Folyadékkromatográfia Mennyiségi analizis: - A kromatográfiás csúcs alatti terület vagy a csúcsmagasság alapján - Kalibráció készítése különböző koncentrációjú standard oldatokkal c5 c5 Csúcsterület c1 c1 Koncentráció (ng/ml) Standard oldatok kromatogramja Kalibrációs egyenes

Folyadékkromatográfia Mennyiségi analizis: Vörösfenyő kivonat elválasztása HPLC-vel Mintabemérés: 1 mikroliter Mozgófázis A: víz Mozgófázis B: acetonitril Mozgófázis C: víz/acetonitril 95:5 + H3PO4 pH=1.56 Mozgófázis D: víz/acetonitril 95:5 + puffer pH=4.22 Mozgófázis gradiens program: 0 - 11.14 perc: 27-33%B (73-67%A) 11.14 – 16 perc: 33-80%B (67-20%A) 16 – 20 perc: 80%B (20% A) Detektorjel Mozgófázis gradiens Név retenciós idő Terület % Csúcsterület Arány % Retenciós idő (perc) Kiértékelés

Gázkromatográfia Gázbeviteli rendszerek Mintabeviteli rendszerek Kolonnák (állófázis) és kolonnatér Detektorok Számítógépes rendszer

Gázkromatográfia - Mozgófázis: gáz (He, H2, N2, stb.) - Állófázis: szilárd (adszorpció) v. megosztó folyadék (abszorpció) Kolonna típusok: szemcsés töltetű (töltött kolonna) nyitott cső (kapilláris) (dbelső< 1 mm) PLOT, WCOT, SCOT kolonnák Megosztó folyadék típusok: - polisziloxán vázúak, polietilén-glikolok, poliglikol-észterek, ftálsav-észterek

Gázkromatográfia Gázkromatográfiás készülékek A gázkromatográfiás készülékek általános felépítése

Gázkromatográfia A mintaáram osztó (splitter) vázlata

Gázkromatográfia A hidrogénláng-ionizációs detektor felépítése

Gázkromatográfia Minőségi azonosítás a retenciós idők közvetlen összehasonlításával

Folyadékkromatográfia Felhasznált források: 3200 Qtrap LC/MS/MS system – Applied Biosystems (termékkatalógus) Morlock, G (2003): Workshop – Planar Chromatography – Part2, HPTLC, Lyon, 2003 Camag Bibliographic Service: Parameters of Planar Chromatography Morlock, G (2003): Workshop – Planar Chromatography – Part1, HPTLC, Lyon, 2003 Morlock, G (2003): Workshop – Planar Chromatography – Part2, HPTLC, Lyon, 2003 - Camag application notes: Detection of carcinogenic amines as degradation products of azo-dyes in leathers Camag application notes HPTLC identification of Astragalus and Hedysarium