Kromatográfia Balla József: A gázkromatográfia analitikai alkalmazásai, Abigél Bt., Budapest, 1997. Fekete Jenő: Folyadékkromatográfia, BME jegyzet, Budapest,

Az előadások a következő témára: "Kromatográfia Balla József: A gázkromatográfia analitikai alkalmazásai, Abigél Bt., Budapest, 1997. Fekete Jenő: Folyadékkromatográfia, BME jegyzet, Budapest,"— Előadás másolata:

1 Kromatográfia Balla József: A gázkromatográfia analitikai alkalmazásai, Abigél Bt., Budapest, 1997. Fekete Jenő: Folyadékkromatográfia, BME jegyzet, Budapest, 2003. Gáspár Attila: Kapilláris zónaelektroforézis, DTE, Debrecen, G. Subramanian, Chiral Separation Techniques, Wiley, 2007. R.P.W. Scott, Principle and Practice of Chromatography,

2 Kromatográfiás folyamat
Kromatográfia elválasztási módszer. Kromatográfiában az állófázis és a mozgófázis között megoszlanak az anyagok megoszlanak egyensúlyi állandójuk szerint. A mozgófázis magával ragadja a vizsgálandó anyagot, amely így a beinjektálási ponttól a detektorig jut. Az állófázissal erősebb kölcsönhatással rendelkező anyagok később eluálódnak mint a gyengébb kölcsönhatással rendelkezők. Az anyagok vándorlásuk során egyre szélesebb tartományt foglalnak el.

3 Egy csúcs megoszlása az állófázis és mozgófázis között
Az állófázisban lévő anyag lemarad a mozgófázisban lévőtől az anyagátadási ellenállás miatt

4 A csúcsok szélesedése a diffúzió miatt
Az anyag kromatográfia során egyre szélesebb tartományt foglal el a diffúzió és az egyenlőtlen V alakú áramlás miatt.

5 Csúcsszélesedés az egyenlőtlen áramlás miatt

6 Csúcsok szélesedése az egyenlőtlen áramlás és az anyagátadási ellenállás miatt
Egyenlőtlen áramlás csatornába, zegzugosság IIdő míg a közepéről a falhoz, anyagátadási ellenálás a mozgó fázisban Üregek rosszul öblitettek csak diffuzióval kerülnek elő R. L. Snyder, J.J. Kirkland, Introduction into Modern Liquid Chromatography, Wiley, 1979

7 Kromatográfiás elválasztás modellezése

8 Elválasztás kisebb oszlopátmérővel vagy hosszabb oszloppal lehet javítani
GC Chirasil-Dex 10 m SFC

9 Kromatográfiás csúcs

10 Csúcsalak formái

11 Kromatográfiás kifejezések
Elméleti tányérszám N = 5,54 (tR/wh)2 Kapacitás arány k = tR’/t0 A csúcs Gauss görbe alakú

12 Az elérhető hatékonyság nem függ a mozgófázistól.
M.L. Lee, Ph.D course A diffúzió és az anyagátadási ellenállás ellentétes hatással van a hatékonyságra, ezért a hatékonyságnak optimuma van az áramlás függvényében.

13 Kromatográfiás kifejezések
Szelektívitás = tR2’/ tR1’ Felbontás Rs = 1,177 (tR1-tR2)/Wh1+Wh2) Rs : 1,5 alapvonal felbontás

14 Felbontás csúcsarány összefüggés eltérő nagyságú csúcsoknál
Nagyságrendekkel eltérő mennyiségű csúcsok pontos Kiértékeléséhez Rs >1,5 érték szükséges.

15 Nem kellően elvált csúcsok területének meghatározása bizonytalan
V.R. Meyer, Chromatographia 40 (1995) 15.

16 Aszimmetrikus csúcsok területének meghatározása bizonytalan

17 A hegyesebb csúcsok jobb elválasztást adnak

18 Felbontás függése k, n és  értékétől
A mindennapi gyakorlatban fontos szerepet játszik felbontás növelése mellett az analízis idő csökkentése és a túlterhelés elkerülése is. P. Sandra, HRC 12 (1989) 82. Az ideális kromatográfiás paraméterek kompromisszumok eredménye.

19 Túlterhelés hatása

20 Kis mintamennyiség is túlterhelheti a kromatográfiás rendszert
Oszlop: 10 m x 0.1 mm CSP: Chirasil-Dex Vivő gáz: H2 Hőmérséklet: 170C Származék: ciklikus dikarbonát GC Extrém eset, általában 1-2 nagyságrenddel jobb.

21 Túlterhelés problémái

22 Kromatográfia felosztása

23 Kromatográfia felosztása oszlop szerint
Töltetes oszlop kromatográfia Kapilláris oszlop kromatográfia Chip kromatográfia Vékonyréteg kromatográfia (TLC) Kromatográfia felosztása kölcsönhatások szerint Megoszlásos kromatográfia Adszorpciós kromatográfia Kizárásos, gél (exclusion) kromatográfia Ioncserés kromatográfia

24 Kölcsönhatások típusok megoszlásos kromatográfiában
A HPLC és CE-ben az ionos kölcsönhatásoknak nagy a szerepe. Királis kromatográfiában a taszító kölcsönhatások fontos tényezők.

25 Chipek, mint kromatográfiás oszlopok
EKC Mars szondán használt kromatográf

26 Kapillárisok a királis kromatográfiában
Kapilláris: GC, SFC, CE, CEC Töltött: SFC, HPLC

27 Töltetes és kapilláris oszlopok összehasonlítása GC-ben
A kapillárisok kisebb áramlási ellenállása miatt sokkal hosszabb oszlopokat használatát teszi lehetővé, ami nagyobb hatékonyságot és ezért jobb felbontást biztosít.

28 Különböző kölcsönhatási erők szerepe egyes kromatográfiás módokban
Ideális kromatográfiás Módok egyes anyagokra GC Könnyenilló, hőstabil vegyületek HPLC Poláros, nehezen illó, hőre bomló vegyületek EKC Ionos vegyületek

29 Királis kromatográfia felosztása I
Közvetlen módszer (direkt ) A szelektorok és a vizsgálandó anyagok kromatografálás közben alkotnak ideglenes diasztereomer asszociátumokat. A közvetlen módszernél a diasztereomer asszociátumok stabilitási különbsége eredményezi az elválasztást. Közvetett módszer (indirekt) A diasztereomer asszociátumokat kromatografálás előtt szintetizáljuk, és ezeket akirális állófázison analízáljuk

30 Királis kromatográfia felosztása II.
Oszlop szerint: töltetes, kapilláris (üres cső), TLC és chip Mozgófázis szerint: GC, SFC, LC, EKC és CEC EKC és CEC a kapilláris elektroforézis (CE) és a kromatográfia kombinációja Szelektor helye szerint: királszelektív állófázis (CSP), királszelektív mozgófázis adalék (CMA)

31 A királis állófázis (chiral stationer phase, CSP) működési elve
C. Welch et al., Review of Stereochemistry

32 A királis mozgófázis adalék (chiral mobile phase addtitive, CMA) működési elve)
C. Welch et al., Review of Stereochemistry

33 Kromatográfia előnyei a királis analízisben
Magas ee. (> 99.9%) esetén is pontos eredmény Nincs szükség optikailag tiszta standardokra Kis mintaszükséglet Egy analízis alatt több enantiomer pár is meghatározható Gyors módszer Mátrix komponensek zavarása kiszűrhető Széles lineáris tartományú módszer On-line kapcsolás a szerkezetazonosító módszerekhez Fejlett műszerezettség, automatizáltság Az enantiomer párok tagjainak jelét egymástól függetlenül értékelii a rendszer. Az első két pont. A jelek egymástól függetlenül, azonos reszponzal jelentkeznek. Single cell analysis A szétválsztott anyagok egymástól függetlenül.laktonok, NMR A erc töredéke alatt Megfelelő kromtográfiás paraméter, több dimennzió, MS kapcsolat Detektorok fázisok kapacitása. ON-line MS, IR, NMR, CD Precizitás, éjszakai működés

34 Kromatográfia előnye a királis elválasztásban
GC GC Példák Mátrixhatás kiküszöbölhető, Gyors módszer nyomnyi mennyiségek meghatározhatóak

35 Egy analízis alatt számos komponenst lehet meghatározni
GC Az egy analízis alatt többre is példa, flexibilis szelektor sok molekula, ChiraSIL-dex ALAFA, BÉTA, GAMMA, CHIRASIL-Val csak szubsztituálatlan alfa

36 A különböző kromatográfiás módok előnyei a királis analízisben
Tulajdonság GC SFC HPLC EKC Hatékonyság ++++ +++ ++ Analízis hőmérséklet + Mozgó fázis hangolása / Analízis sebessége Érzékenység Kidolgozottság

37 Különböző kölcsönhatások szerepe az egyes királis kromatográfiás módokban
Típus GC SFC HPLC EKC Diszperziós ++++ +++ ++ +  -  Dipól - dipól Hidrogén-híd Ionos / Taszító A királis felismerő kölcsönhatásoknak legjobban megfelelő módot érdemes kiválasztani. GC a funkciós csoport nélküli szénhidrogén enatiomerek elválasztására is alkalmas.

38 A királis kromatográfia általános szabályai
Merev szerkezet nagy szelektivitást tesz lehetővé. Flexibilis szerkezet széles felismerési spektrummal rendelkezik. A z elválasztások túlnyomó része a hárompontos kölcsönhatásokra vezethető vissza. Királis centrumhoz közeli funkciós csoportok segítik az elválasztást. A taszító kölcsönhatásoknak nagy szerepe van. A szelektivitásoknak az alacsony analízis hőmérséklet kedvez.

39 A királis elválasztás energiaigénye és hőmérséklet függése
ln α = S+- (S0sm)/R - H+- (H0sm)/RT  +- : különbség a két izomer (+ és -) között sm: különbség a két fázis (álló és mozgó) között Az esetek 99%-ában kromatografálás hőmérséklet csökkentése exponenciálisan javítja az elválasztást. A hőmérséklet csökkentésesének az analízis ideje, hatékonyság, és a minták kromatografálhatósága szab határt. Az Rs 1,5 eléréséhez 0,1kJ/mol kölcsönhatás energiakülönbség (α: 1,01) is elég lehet. Entalpia tartomány ha chöm csökkentésével nő az alfa. Ha a görbe eltér a lineáristól több felismerő mechanizmus. Alacsonyhőmérsékleten megfagyhat a mozgófázis, vagy az álló, romlik a hatásfok. Nincs elég tenzió.

40 Enantiomereknek fordított az elúciós sorren-dje az entalpia és az entrópia tartományban

41 A flexibilis szelektrorok szelektívitása mérsékelt
Flexibilis szelektorok (pl. CDk) mérsékelt szelektivitását nagy hatékonysággal lehet kompenzálni. Ezeket főleg kapilláris oszlopoknál alkalmazzák. Akár  = 1,01 is alapvonal elválást eredményez. GC Az egy analízis alatt többre is példa, flexibilis szelektor sok molekula, ChiraSIL-dex ALAFA, BÉTA, GAMMA, CHIRASIL-Val csak szubsztituálatlan alfa

42 A merev imprinted állófázis nagy szelektívitást biztosít néhány enantiomer pár felé
CEC Adott enantiomer, bifunkciós reagensek, polimerizálás, kioldás. Adott termékre érdemes kifejleszteni. O. Brügemann Molecular Imprinted Mat. Adv. In Biochem Eng. 76 (2002) 127. Imprinted állófázisok nagy anyagátadási ellenállással rendelkeznek ezért hatékonyságuk mérsékelt

43 Nyomnyi mennyiségek meghatározása nagy csúcs mellett, több nagyságrendet átfogva
Kis csúcs elsőként elúciója ajánlott, hogy a nagy csúcs farka (tailingje) ne fedje el.

44 Fordított elúció CSP váltással

45 Kis csúcs előbb pontosabb eredményt ad

46 Reakció Dani reagenssel
A reagens kiralitása meghatározza az elúciós Sorrendet. Péter A., D.Sc. tézisek 2004

47 Királis kromatográfiában leggyakrabban használt oszlopok jellemzői
Tulajdonság Oszloptípus Kapilláris Töltetes Előny Nagy hatékonyság Terhelhetőség Oszlop hossz EKC: 0,05 –0,5 m GC: m 0,05 – 0,5 m Rs> 1,5- höz szükséges  1,01-1,03 1,1-1,3 Alkalmazott CSPk és CMAk Kevésbé szelektív, gyors (ciklodextrinek) Nagy szelektivitású (cellulózok) Kromatográfiás mód GC, SFC, EKC HPLC, SFC, CEC

48 Királis elválasztások javításának lehetőségei a kromatográfiában
Hatékonyság javítása (oszlopméret, optimalizált fázisok) Szelektivitás javítása (akacsony analízis hőmérséklet, optimalizált fázisok, akirális származékképzés) Csúcsok elúciós sorrendjének megválasztása Megfelelő kromatográfiás mód kiválasztása összhangban a szelektorral és mintával

49 Enantiomerarány meghatározását zavaró hatások a kromatográfiában

50 Kromatográfia hátrányai a királis analízisben
Mérsékelt terhelhetőség Szakaszos üzemmód Korlátozott szerkezeti információk Az állófázisok nem csak királis szelektorokból állnak. A két fázis közül valamelyik könnyen túltelíthető, nem lineáris Langmuir.

51