Lipopoliszacharidok meghatározása talajból

Lipopoliszacharidok (LPS) A Gram-negatív baktériumok külső membránjának építőelemei. Felépítésük: Lipid (lipid A) Poliszacharid mag O-specifikus oldallánc LPS zsírsavak alkotják a sejt összes zsírsavainak 15-20%-át Gram-negatív baktériumoknál

Lipopoliszacharidok (LPS) Saddler és Wardlow (1980.) vizsgálták a holt baktériumok LPS-jainak gyors bomlását talajokban LPS zsírsavak Gram-negatív baktériumok biomassza meghatározására használhatók -hodroxi-mirisztinsavat használták LPS-meghatározásra talajban (Smith et al, 1986.) LPS hidroxi savak alapján is meghatározható a talajban lévő életközösség összetétele (Parker et al, 1985.)

A mérés elve A talajmintát Bligh and Dyer eljárással extraháljuk, hogy kivonjuk a a foszfolipid zsírsavakat. Ezután savas hidrolízist végzünk, majd a felszabadult zsírsavakat észteresítjük, elválasztjuk egy szilárdfázisú kolonnán, végül a hidroxi-zsírsavakat GC-MS analízissel határozzuk meg.

Lipid extrakció Talajminta  szűrés kovaföld szűrőn 500ml-es lombikba tesszük a szűrt mintát, rotációs bepárlóban szárítjuk, majd120 ml 4 M HCl-ben oldjuk Refluxálás után (100°C, 5 óra, majd hűtés) a zagyot leszűrjük Celite 545-ön (2 cm rétegvastagság) Anyalúg extrakciója 250ml-es extrahálótölcsérben 60, 40, 40 ml kloroformmal Az extraktumot (szabad zsírsavakat tartalmaz) Na2SO4 felett szárítjuk, az oldószert vákuumban távolítjuk el

Szabad zsírsavak észteresítése Lipid-frakció: 4 ml-es üvegcsébe öntjük, majd eltávolítjuk az oldószert 40°C-os nitrogénárammal Észteresítés: 2 ml metanol:kloroform:cc.HCl (10:1:1 v/v) eleggyel, 60°C-on tárolás egy éjszakán át Hozzáadunk: 2 ml 2%NaCl oldatot, 4 ml hexán-toluol (1:1 v/v) elegyet  centrifugában két fázisra bontjuk Ismétlés háromszor, majd Na2SO4-tal szárítás Kloroform mennyiségének csökkentése bepárlással, tárolás -20°C-on

Hidroxi-zsírsavak elválasztása Hidroxi-zsírsav-metilészterek (OH-FAME) elválsztása a nemszubsztituált zsírsavaktól szilárd fázisú extrakcióval (SPE-NH2 kolonna, 1 v. 2 g) Oszlopra: 1 rész diklorometán, majd 1 rész hexán Minta feloldása kevés hexán:diklorometán (3:1 v/v) elegyben, majd felvitel az oszlopra Az összes foszfolipid-zsírsav-metilészer kinyerése két oszlop-térfogatnyi hexán:diklorometán (3:1 v/v) eleggyel történik OH-FAME kinyerése két oszlop-térfogatnyi diklorometán:etilacetát (9:1 v/v) eleggyel történik

Szilán-származék képzés Célja az analitikai mérés érzékenységének növelése. 0,5 ml frissen készített piridin:N,O-bis-(trimetilszilil)-trifluoroacetamid:hexametil-diszilazán:trimetil-kloroszilán (TMSi) (0,2:1:2:1 v/v) hozzáadása a megadott sorrendben, minden hozzáadás után megkeverve 60°C-on melegítés 15 percig Oldószer eltávolítása nitrogén-áram alatt

GC-MS meghatározás Zsírsav-metilészterek feloldása 0,1 ml hexánban (nonadekánt tartalmaz belső standardként 19:0) 1 µl-t injektálunk a GC-MS-be Mérés SCAN vagy SIM módban Kapilláris kolonna (50m x 0,2 mm i.d., 0,33mm df), 5% fenil-metillel módosított szilikonváz

GC-MS meghatározás Splitless mód He-vivőgáz, áramlási sebesség 0,25ml/perc Termosztálás: 70°C 2 percig, emelés 160°C-ra (40°C/perc), majd emelés 280°C-ra (3°C/perc), injektor 290°C Elektronsokszorozó: U = 1800-2000V Átvezető cső: 300°C

Kiértékelés Standard: reprezentatív talajminta extraktum (tartalmaz minden jelen lévő FAME-t) Standard mérése SCAN és SIM módban is Az egyes OH-FAME-k mennyisége becsülhető (SCAN-mérés alapján): Ahol: C: a vizsgált anyag mennyisége (nM/g) Rf és Ri: a vizsgált anyag és a belső standrad által adott jel m: a belső standard mennyisége (ng) MW: vizsgált anyag molekulatömege A: injektált minta mennyisége (mg) k: a vizsgált anyag és a belső standard intenzitás-aránya

Összefoglalás Különböző eljárásokat fejlesztettek ki a zsírsavak felszabadítására LPS-ból: savas, bázikus hidrolízisen, ill. mindkettőn alapuló eljárásokat (Wollenweber and Rietschel, 1990.) A leírt módszer mintegy ötször érzékenyebb a klasszikus a fenol-víz vagy trikloroecetsav módszernél. LOD (kimutatási határ): 1ng/g

Felhasznált irodalom Alef K. and Nannipieri P. (Editors): Methods in Applied Soil Microbiology and Biochemistry, Academic Press Limited, London, 1995 Sarkadi Lívia: Biokémia mérnök szemmel, Typotex Kiadó, 2007