β-glükozidáz aktivitás mérése talajban

Az előadások a következő témára: "β-glükozidáz aktivitás mérése talajban"— Előadás másolata:

1 β-glükozidáz aktivitás mérése talajban

2 Enzimek globuláris fehérjék jellegzetes térszerkezet specifikusság
biológiai katalizátorok: vagy egy reakciótípust vagy egy bizonyos anyag átalakulását katalizálják a reakciók lebonyolításában az aminosav- oldalláncok által kialakított aktív centrum vesz részt

3 Az enzimek működése egy enzimkatalizált reakcióban az enzim aktív centrumában ideiglenesen megköti a szubsztrátot és létrejön egy enzim-szubsztrát komplex a reakció lejátszódásával termék keletkezik, amely leválik az enzimről, majd az enzim visszakerül eredeti állapotába függ: kémhatás, hőmérséklet

4 Az enzimek működése 1. ábra:

5 Enzimaktivitás az enzim mennyiségét az enzimaktivitással szokták jellemezni tulajdonképpen reakciósebességet jelent, vagyis azt jelenti, hogy a jelen levő enzimmennyiség szigorúan meghatározott szubsztrát koncentráció mellett, időegység alatt, mennyi szubsztrát átalakulását katalizálja egysége: 1 µmol/perc, catal

6 Enzimaktivitást befolyásoló tényezők
enzimkoncentráció szubsztrátkoncentráció kémhatás hőmérséklet inhibitorok, aktivátorok

7 β-glükozidáz mikroorganizmusokban, növényekben és állatokban is egyaránt megtalálható hidroláz enzim a cellulózt hidrolitikusan hasítja glükóz molekulákká a diszacharidokat hidrolizáló glükozidázok csoportjába tartozik a talajban sokkal nagyobb jelentőségű, mint az ugyanebbe a csoportba tartozó α- glükozidáz és α- és β-galaktozidáz

8 Hidrolízis 2. ábra: Alef K. and Nannipieri P. : Methods in Applied Soil Microbiology and Biochemistry a hidrolizáló enzimek víz belépésével két részre hasítják a szubsztrátmolekulákat a szubsztrátmolekulák egy részét az OH- csoportra viszik át, míg a víz protonja a szubsztrátmolekula másik részére kerül

9 β-glükozidáz aktivitás mérése
leggyakrabban p-Nitrofenil-β-d-glükozidot használnak szubsztrátként ennél a szubsztrátnál Km értéke általában 1,3-2,4 mM (Michaelis-állandó (Km): az a szubsztrátkoncentráció, amelynél a maximális ( vmax) felét éri el a reakciósebesség) 70°C-on inaktiválódik és jelentős összefüggést mutat a talaj szeversanyagával

10 β-glükozidáz aktivitás vizsgálata (Tabatabai 1982; Eivazi és Tabatabai 1988)
alapja a p-nitrofenol csökkenésének meghatározása, a talaj p-nitrofenil glükozid oldat inkubációja után az inkubáció időtartama 1 óra; hőmérséklet: 37 °C 3. ábra: Alef K. and Nannipieri P.: Methods in Applied Soil Microbiology and Biochemistry

11 Szükséges eszközök és anyagok
Toluol MUB (modified universal buffer) puffer (pH=6) 0,5 M CaCl2 0,1 M TRIS puffer (pH=12 és 10) Standard p-Nitrofenol oldat 25 mM p-Nitrofenil-β-d- glükozid (PNG) oldat (0,377 g PNG-t 40 ml MUB pufferben oldva, 50 ml-re hígitva) Spektrofotométer Erlenmeyer lombik (50 ml) 37°C –os vízfürdő, rázató Szűrőpapír

12 A mérés metodikája 1g nedves talajt Erlenmeyer lombikba helyezünk, majd hozzáadunk 0,25 ml toluolt, 4 ml MUB oldatot és 1ml PNG oldatot lezárva 1 órán keresztül 37°C-os rázatóban inkubáljuk az inkubáció után hozzáadunk 1 ml CaCl2 oldatot , 4 ml TRIS puffert (pH=12), összekeverjük a lombikban és szűrőpapírral azonnal leszűrjük a szuszpenziót spektrofotométerrel 400 nm-en megmérjük az intenzitást (ha túl magas, azaz nem fér bele a mérhető tartományba, akkor pH=10-es TRIS pufferrel hígítani kell a szűrletet) vakoldat készítése mérés megismétlése 3x (ugyanahhoz a vakoldathoz)

13 β-glükozidáz aktivitás vizsgálata (Hoffmann és Dedeken 1965)
alapja a salignin (2-oxymetil-fenol) csökkenésének meghatározása salicin 2-( hidroximetil)fenil –β-D- glükopiranozid (β-glükozid salignin) talajban történő inkubálása után az inkubálás időtartama 3 óra; hőmérséklet: 37 °C

14 Szükséges anyagok és eszközök
2 M acetát puffer (pH=6,2) Borát puffer (pH=9,6) Dibróm-kinon -klórimid oldat (200 mg 100 1/ml etanol) 2,306 g β-glükozid salignin oldat Standard salignin oldat (0,1 mg/ml) toluol Spektrofotométer Mérőlombik (50 ml) 37 °C-os vízfürdő, rázató Szűrőpapír

15 A mérés metodikája mérőlombikba 5 g nedves talajt helyezünk, majd hozzáadunk 1 ml toluolt és 15 percig állni hagyjuk, szobahőmérsékleten ezután hozzáadunk 10 ml-t a szubsztrát oldatból és 20 ml acetát puffert, majd 3 órán keresztül 37°C-on inkubáljuk az inkubálás után desztillált vízzel 50 ml-re hígitjuk, összekeverjük és leszűrjük a szűrletből 1-3 ml-t mérőlombikba pipettázunk és hozzáadunk 20 ml acetát puffert, 2 ml borát puffert és 0,5 ml dibróm-kinon-klórimid oldatot desztillált vízzel 50 ml-re töltjük és 90 perc után, 578 nm-en mérjük az abszorbanciát a vakoldat elkészítéséhez 10 ml desztillált vizet adunk a szubsztrát helyett a mérést háromszor megismételjük (ugyanazzal a vakoldattal)

16 Felhasznált irodalom:
Alef K. and Nannipieri P. (Editors): Methods in Applied Soil Microbiology and Biochemistry. Academic Press Limited. London Boross László, Sajgó Mihály: A biokémia alapja. Mezőgazda Kiadó Kft. 2003 Ádám Veronika: Orvosi biokémia. Medicina. 2004 Sarkadi Lívia: Biokémia mérnök szemmel. Typotex. 2007