Készítette: Bukri Gergely Budapesti Műszaki és Gazdaságtudományi Egyetem 2011.

Az előadások a következő témára: "Készítette: Bukri Gergely Budapesti Műszaki és Gazdaságtudományi Egyetem 2011."— Előadás másolata:

1 Készítette: Bukri Gergely Budapesti Műszaki és Gazdaságtudományi Egyetem 2011

2  Az aminocukrok jelentős mértékben hozzájárulnak a talaj szerves nitrogén tartalmához (5-12%), ez részben a mikrobiális eredetnek köszönhető. (Stevenson 1982; Joergensen és Meyer 1990)  A talajban megtalálható legfontosabb aminocukrok a glükozamin, a galaktózamin és a muramin sav, bár számos más aminocukor is létezik. (Stevenson 1983; Amelung 2001)  A talaj glükozamin tartalmának meghatározása segítségével tudjuk becsülni a biomassza nagyságát. Ez azért lényeges, mert a biomassza mint indikátor figyelmeztet a kedvezőtlen változásokra.

3 A prokarióták sejtfalának egy sajátos vegyülete a peptidoglikán, amelyben N-acetil-glükozamin (N-acetil-2- amin-2-dezoxi-D-glükóz) és N-acetil muraminsav láncai kapcsolódnak egy alaninból, glutaminból és lizinből vagy diamino-pimelinsavból álló tripeptidhez.

4 Számos gomba sejtfala - beleértve a magasabb rendűeket is - tartalmaz kitint (Bartnicki-Garcia 1968), amit főleg N-acetilglükozamin épít fel, továbbá a gerinctelen állatok kitinvázában is megtalálható. A gombák glükozamin tartalma igen széles skálán változik, függ a fajtól, a fejlődési ciklustól (mérettől) és az életkortól is. A talajban lévő glükozamin nagy részét fedezi ez a forrás.

5 A talajmintákból a glükozamin erősen savas, HCl-al (sósav) végzett hidrolízis segítségével mutatható ki. Ezt a lépést kation-cserélőn történő kromatográfiás tisztítás követi (Frankland et al 1978). Ahhoz, hogy a kation-cserélős lépés elhanyagolható legyen, Grant és West (1986) glükozamint határoztak meg talaj hidrolizátumból papír kromatográfiás módszerrel.

6 A mennyiségi meghatározás kivitelezhető kolorimetriásan (Zelles et al 1987), de sokkal pontosabb eredményhez jutunk gázkromatográfiás (Hicks és Newell 1983) vagy HPLC (nagy teljesítményű folyadék-kromatográfiás) technológia alkalmazásával (Zelles 1988).

7  Aaronson 1981-ben arról számolt be, hogy a kitin koncentrációja a különböző gombafajokban 10 és 250 mg/g között mozgott szárazanyagra vonatkoztatva.  Hicks és Newell 1984-ben leírták, hogy a glükozamin- tartalom 8,5-től 92,8 μg/mg –ig változott szárazanyagra vonatkoztatva.  Grant és West 1986-ban 505-2109 μg mennyiséget mért, Zelles és társai 1990-ben pedig 3500 μg körüli értéket az erdei talajok szerves rétegében és 137-479 μg-ot az erdei talajok ásványi rétegében.

8 West és társai 1987-ben úgy vélték, hogy a tárolásnak nincsen nyilvánvaló hatása a glükozamin koncentrációjára, ezzel szemben pár évvel később Zelles csapatával arra a következtetésre jutott, hogy a mintában a tárolás során megnőtt a glükozamin koncentrációja (Zelles et al 1991). Mindezek alapján megállapítható, hogy a vizsgálatok során nem lehet figyelmen kívül hagyni a tárolás hatásait.

9 Ha a glükozamin-elemzést használjuk a gombás biomassza felmérésére, jelentős problémaként jelentkezik, hogy glükozamin-többlettel kell számolni a prokarióták és gerinctelenek mintában való jelenléte miatt. Első lehetőségként a glükozamint el lehet számolni úgy, hogy felmérjük a muramin sav mennyiségét a mintában és feltételezzük, hogy muramin sav – glükozamin mólaránya 1:1.

10 A muramin sav elemzése során azonban a glükozamin meghatározásának fő problémája, hogy a glükozamin jelen van a nem-élő szerves anyagban (Tunlid and White 1992). A biomassza adatok alapján történő számszerű kiértékelések már korábban is igazolták, hogy a nem-élő szerves anyagokban jelen lévő glükozamin jelentősen hozzájárul az összglükozamin- koncentrációjához. (Grant and West 1986).

11 A muraminsav meghatározásának menete alkalmazható a glükozamin meghatározásánál is. Minden a muraminsavnál leírt paraméter érvényes a glükozamin tesztre is.

12 A módszer a glükozamin talajból történő extrakcióján, a HCl-al történő hidrolízisen, valamint a papírkromatográfiát követő mennyiségi meghatározáson alapul.

13  Spektrofotométer  Rotációs bepárló  Kromatográfiás papír  Kromatográfiás kamra  Rotációs rázógép  Vízfürdők állítható hőmérséklettel (15°C-100°C)  Szűrőpapír (Whatman GFC)  Centrifuga és csövek

14  HCl (12 M )  Trimetilklór (1% toluolban)  Pelyhes NaOH  Mozgó fázis I Bután-1-ol/piridin/ecetsav (tömény) / víz (60:40:3:30 v / v)  Mozgó fázis II Piridin/víz (4:1 v / v)  Ninhidrin reagens  H 2 SO 4 (koncentrált)  Metanol  Glükozamin standardoldat

15 Részminta előkészítés, extrakció és vizsgálati eljárás alkalmazása a talaj glükozaminra megegyezik az diaminopimelinsavnál használatossal a következők teljesülése esetén:  A talajmintákat inkubáljuk 10 ml HCl-al (12 M), 25 °C-on, N 2 -áram alatt 48 óra,  majd hígítjuk desztillált vízzel (30 ml) és N 2 –áram alatt hidrolizáljuk 100 ° C-on 6 órán át.

16  A hidrolizátumok szűrleteit kiegészítjük 100 ml-re (desztillált vízzel), hozzá adunk 10 ml részmintát, majd kromatografáljuk az eredeti glükozamin oldat térfogatával 48 órán át első osztályú Whatman szűrőpapíron 60:40:3:30 (v / v) oldószer arány mellett.

17  4-5 nap elteltével glükozamin foltok jelennek meg a szűrőpapíron, melyeket tömegállandóságig szárítjuk, majd analitikai mérlegen visszamérünk. A homogenitás tesztelésére a piridin:víz (4:1 v / v) arány mellett végzett kromatográfia alkalmas.  Megjegyzés: A glükozamin-veszteség az extrakció és az elemzés során igazoltan mintegy 8%.

18  Alef K. and Nannipieri P. (Editors): Methods in Applied Soil Microbiology and Biochemistry, Academic Press Limited, London, 1995  http://www.tankonyvtar.hu/biologia/oxford- typotex-biologiai-080905-52  http://www.akademiai.com/content/w079565 5426r4831/  Képek: http://www.everystockphoto.com/photo.php?i mageId=1667167