FDA hidrolízis aktivitási teszt

Az előadások a következő témára: "FDA hidrolízis aktivitási teszt"— Előadás másolata:

1 FDA hidrolízis aktivitási teszt
Készítette: Zách Attila

2 Bevezetés Az FDA a fluoreszcein-diacetát (3’,6’ diacetil-fluoreszcein) rövidítése. Az FDA-t számos enzim képes hidrolizálni: lipáz, proteáz, észteráz -> termék: fluoreszcein A természetes élőhelyeken a mikrobiális össz-aktivitás nyomon követése a szervesanyag-körforgalom mérésére alkalmas módszer (ok: az energia több mint 90%-a a mikrobiális lebontókon áthalad).

3 A módszer rövid ismertetése
A mikrobiális össz-aktivitás meghatározására alkalmas módszernek tekintik. Aktív gombák, baktériumok mennyiségi meghatározására, acetil-észteráz megállapítására élő egysejtűekben, illetve enzimatikus aktivitás vizsgálatára állati sejtekben. A korábbi vizsgálatok során kiderült, hogy az összes gomba, legtöbb baktérium, néhány protozoa és alga mutat FDA hidrolitikus aktivitást. Gyors, érzékeny, egyszerű módszer. A mikrobiológiai aktivitás következtében fluoreszcein termelődik, és ezt mérjük fluoreszcens mikroszkóppal, fluorimetriásan, vagy spektrofotometriásan.

4 Példa vizsgálható mintatípusokra
Különféle minták FDA-hidrolitikus aktivitása is vizsgálható: Talaj: mezőgazdasági földterületről származó minták különböző rétegekből: a talaj felső része homokos talaj agyagos talaj a talajmintákat két egymást követő napon 120o C-on, 20 percig autoklávozni kell

5 Tiszta mikroorganizmus kultúrák, pl.
Szalma: árpa szalma 2 cm-s darabokra vágás, szobahőmérsékleten tárolás 110o C-on 30 percig autoklávozni Tiszta mikroorganizmus kultúrák, pl. Pseudomonas denitrificans Fusarium culmorum

6 FDA hidrolízis meghatározása
2 mg/ml-es koncentrációjú FDA törzsoldat készítése acetonnal, tárolás: -20 °C az enzimatikus reakció befejezését biztosítja agyagmintánál csökkenti a háttér-abszorbanciát segíti a sejtmembránokat feloldani enélkül nehéz a kolloidok eltávolítása az anyalúgból agyagminták esetén a hidrolizált FDA mennyiséget 490 nm-es hullámhosszon mért abszorbanciából határozzák meg Beckman spektrofotométerrel a 0,8-nál nagyobb abszorbanciájú minták esetében a mintát mérés előtt hígítják a mintákhoz 10 mikrogram/ml FDA-t és 60mM-os nátrium-foszfát puffert adnak, így a pH-t 7.6-ra állítják, és az így kapott keveréket 24 °C-on inkubálják egy forgó keverőn

7 tiszta mikroorganizmus kultúrák esetén:
szalma vizsgálata esetén az inkubáló lombikból kivett minta abszorbanciája közvetlenül meghatározható tiszta mikroorganizmus kultúrák esetén: P. denitrificans: a sejtek 5 percig tartó 6000 fordulatszám/perces centrifugálással való eltávolítása, majd az anyalúgot Munktell no. 3 szűrőpapíron szűrve mérhető az abszorbancia F. culmorum: a micélium 5 percig tartó 6000 fordulatszám/perces centrifugálással való eltávolítása, majd az anyalúg 3 mikrométeres szűrőpapíron való szűrését követően mérhető az abszorbancia talaj vizsgálata során a mintát az inkubálást követően 5 percig 6000 fordulatszám/perc-cel centrifugálták, majd Munktell no. 3 szűrőpapíron szűrték az anyalúgot

8 Kiértékelés Talaj: Szalma: Tiszta kultúra:
FDA hidrolízis aktivitás lineárisan nő az idővel és a talaj mennyiségével csírátlanított talaj nem mutat FDA aktivitást A homok- és az agyagmintákban kicsi az FDA aktivitás Szalma: a csírátlanított minta jóval kisebb aktivitást mutat Tiszta kultúra: P. denitrificans koncentráció-abszorbancia összefüggése lineáris F. culmurum koncentráció-abszorbancia összefüggése lineáris

9 Különböző összetételű talajok FDA hidrolitikus aktivitása
Forrás: Johan Schnürer and Thomas Rosswall, (1982 June), Fluorescein Diacetate Hydrolysis as a Measure of Total Microbial Activity in Soil and Litter, Applied and Environmental Microbiology, Vol 43(6), 1258

10 Talajminták inkubálási idejének, és hidrolitikus aktivitásának a kapcsolata
Forrás: Johan Schnürer and Thomas Rosswall, (1982 June), Fluorescein Diacetate Hydrolysis as a Measure of Total Microbial Activity in Soil and Litter, Applied and Environmental Microbiology, Vol 43(6), 1258

11 A módszer feltételei: megfelelő pH megfelelő hőmérséklet
pH=7.6 szükséges, nátrium-foszfát pufferrel állítják be pH érzékenység oka, hogy alacsony és magas pH-n nincs FDA hidrolízis aktivitás megfelelő hőmérséklet inkubálással biztosítható a megfelelő hőmérséklet, a mintákat 24 °C-on inkubáljuk forgókeverőn légzés (O2 érzékeny) összefüggés van az O2 és az FDA hidrolitikus aktivitás között, a legjobb aktivitás a talajminták közül a felsőtalajban mérhető, az aktivitás csökken a mélység növekedésével a légzés mértékét, mint az O2 fogyasztást határozták meg, 15 °C-on Gilson respirométerrel

12 Hátrányai Jobban alkalmazható a heterotróf aktivitás meghatározására, mint a biomassza mennyiségének meghatározásra. ok: az aktív biomassza nem egyenesen arányos az ismertetett módszer által mért FDA hidrolízis aktivitással a FDA mikroszkóp az aktív és inaktív biomassza között csak különbséget tud tenni Megfelelő, és pontos előkészítés szükséges: ATP hidrolízis elkerülésére megfelelő inkubálás, pH A fent felsorolt hátrányok ellenére mégis jó módszer a mikrobiális össz-aktivitás meghatározására.

13 Forrás Schnürer, J. and Rosswall, T. (1982), Fluorescein Diacetate Hydrolysis as a Measure of Total Microbial Activity in Soil and Litter, Applied and Environmental Microbiology, Vol 43(6), p