Ureáz aktivitás mérése Készítette: Majoros Katalin

Bevezetés Az enzimek biológiai katalizátorok, melyek alapvető szerepet töltenek be a sejtek anyagcsere folyamataiban. Az enzimek is, mint minden katalizátor, csak olyan folyamatok lejátszódását segítik elő, amelyek egyébként is végbemennének, de a reakció lényegesen lassabban játszódna le. Egy adott kémiai reakció sebességét képesek növelni azáltal, hogy csökkentik annak aktiválási energiáját. 

Az enzimek Az enzimek felépítésüket tekintve fehérjék, emiatt működésük erősen függ a hőmérséklettől és a pH-tól, mindegyikre jellemző egy hőmérséklet- és pH-optimum Az enzimek fajlagosan működnek, vagyis specifikusak: csak egy adott vegyület (vagy vegyületcsoport, a szubsztrát) adott reakcióját katalizálják, amely képes a kérdéses fehérje térszerkezetéből és energetikai viszonyából adódóan ahhoz kapcsolódni az ún. aktív centrumon. Az enzimfehérjék térbeli szerkezete az, ami lehetővé teszi a reagáló anyagokkal való kapcsolat kialakítását, azok megkötését. A fehérjék ezen részét nevezzük aktív centrumnak.

Ureáz Az ureáz a karbamid hidrolízisét katalizáló enzim. Megtalálható magasabb rendű növényekben és mikroorganizmusokban. Jelenléte teszi lehetővé a karbamidnak, mint nitrogénforrásnak a felhasználását. Csak bizonyos környezeti feltételek mellett működik hatékonyan. Aktivitását befolyásolja a hőmérséklet és a kémhatás. Optimális pH tartománya 8,5-9 közötti. A baktériumok az ureáz enzim segítségével bontják a húgysavat, miközben ammóniát szabadítanak fel. 

Az ureáz működése és aktivitásmérése Mint már említettem, az ureáz katalizálja a húgysav hidrolízisét szén-dioxidra és ammóniára, karbamid képződése közben. A reakció egyenlete: H2NCONH2 + H2O =2NH3 + CO2 Sokféle módszert fejlesztettek ki az ureáz aktivitásának mérésére talajmintákból Legtöbbjük magában foglalja a toluollal kezelt, pufferelt húgysavoldattal átitatott talajmintából felszabaduló ammónia mennyiségének mérését Más módszerek inkább a felszabaduló szén-dioxid mennyiségéből következtetnek a talajmintában történő húgysavhidrolízis mértékére Megint mások sem toluolt, sem puffereket nem alkalmaznak a mérésekhez

Nehézségek a meghatározásban A sokféle módszer miatt eltérőek a vélemények a pH-optimumot, illetve az optimális hőmérséklettartományt tekintve is: pH-ra a semlegestől a 6-7 tartományon át, a 8.8-10-es értékekig találhatók irodalmi adatok Optimális hőmérsékletre 60°C adódott, de az ureáz általában 70°C-on denaturálódik, a talajminták inkubációjának hőmérséklete 15-40°C tartományban végezhető ( a 30°C az ideális) Ráadásul az ureáz aktivitás nem arányos a mikrobiális biomasszával, és hatását a nehézfémek, az oxigén koncentráció, a bontható nitrogénmennyiség mind-mind befolyásolja A továbbiakban két meghatározási módszert vizsgálunk részletesebben, melyek eltérő módon juttatnak (remélhetőleg) ugyanahhoz az eredményhez.

Tabatabi és Bremner ureáz aktivitás meghatározási módszere (1972) I. A módszer lényege: Az ammóniafelszabadulás mértékének meghatározásán alapul, miután a talajmintákat 2 órán keresztül 37°C-on, húgysavoldattal inkubáltuk Eszközök: Gőzdesztillációs berendezés 37°C-ra állítható inkubátor pH mérő Mérőlombikok (50, 100, 1000, 2000 ml) Automata titráló berendezés Erlenmeyer lombik (100 ml)

Tabatabai-Bremner (1972) II.-vegyszerek és oldatok Toluol Hidroxi-metil-amino-metán puffer (50mM, pH 9) Ebből 6.1 g-ot 700 ml desztillált vízben oldunk, majd addig adagolunk hozzá H2SO4-ot (0.2M), amíg el nem érjük a 9.0 pH-t. Ezután desztillált vízzel 1000 ml térfogatúra töltjük fel Húgysavoldat (200 mM) 1.2 g húgysavat 80 ml pufferoldatban oldunk, majd ugyanezzel a pufferrel 100 ml-re töltjük fel. Minden nap friss oldatot kell készíteni és 4°C-on kell tárolni Kálium-klorid (2.5M)- ezüst-szulfát (100mg/l) oldat Feloldunk 100 mg Ag2SO4-ot 700 ml desztillált vízben, majd 188g KCl-ot ebben az oldatban és desztillált vízzel 1000 ml-re töltjük fel.

Tabatabai-Bremner III.- Az NH4-N meghatározás reagensei H2SO4 (0.005 M) Indikátor oldat Feloldunk 0.66 g brómkrezol zöldet és 0.33 g metilvöröst 95%-os etanolban, és szintén etanollal 1000 ml-re töltjük fel Bórsavas indikátor oldat A 2 l-es mérőlombikba pipettázunk 40 ml-t az indikátor oldatból, és 400 ml-t a 95%-os etanolból. 40 g bórsavat 1400 ml meleg desztillált vízzel keverünk. Hűtés után ezt is a 2 l-es mérőlombikba öntjük. Ezután addig pipettázunk hozzá NaOH-ot (0.05M), amíg 1 ml oldat színe rózsaszínről zöldre változik 1 ml desztillált víz hozzáadásakor. Végül mindezt 2000 ml-re töltjük fel desztillált vízzel. MgO 600-700°C-on hőkezelünk hőstabil MgO-ot 2 órán keresztül, majd hűtjük és kiszárítjuk NaOH-on vagy szilikagélen exikátorban. Ammóniastandard oldat Feloldunk 0.234 g ammónium-szulfátot desztillált vízben, majd 1000ml-re töltjük fel szintén desztillált vízzel

Tabatabai-Bremner IV. – A meghatározás menete 5g nedves talajmintát helyezünk az 50 ml-es mérőlombikba, majd hozzáadunk 0.2 ml toluolt és 9 ml pufferoldatot, ezt összekeverjük, és hozzáadunk 1 ml húgysavoldatot, majd ismét keverjük néhány másodpercig. Ezután az edényt inkubátorba helyezzük ás 2 órán át 37°C-on inkubáljuk. Ezt követően hozzáadunk a mintához kb. 35 ml KCl-Ag2SO4 oldatot, összerázzuk, majd hagyjuk a lombik tartalmát szobahőmérsékletűre hűlni. Miután lehűlt, feltöltjük a káliumos oldattal 50 ml-re, és jól elkeverjük az összetevőket. Ajánlott legalább 3 ismétlést csinálni. Az ammóniameghatározás menete: 5 ml bórsav indikátort pipettázunk egy Erlenmeyer lombikba, és 20 ml talajminta szuszpenziót egy 100 ml-es desztilláló lombikba. Ehhez hozzáadunk 0.2 g MgO-ot és gőzdesztilláljuk, amíg össze nem gyűlik 30 ml desztillátum. Ezt öntjük majd az Erlenmeyer lombikba az indikátorra. A desztillátumot ezután 0.005 M-os H2SO4 oldattal titráljuk. 1 ml H2SO4 70 μg NH4-N-nek felel meg.

Tabatabai-Bremner V.- Számítás Miután a standardokkal ellenőriztük a mérési eredményeink helyességét, a következőképpen számolunk: ureáz aktivitás (μg NH4-N g-1 dwt*2h-1)= (C×50)/(dwt×5) Ahol C: a mért NH4-N koncentráció (1 ml talaj-szuszpenzióban), dwt: 1 g nedves talajminta száraz tömege, 5: a méréshez használt talajtömeg, 50: a talaj-szuszpenzió teljes térfogata

Kandeler és Gerber módszere (1988) I. A módszer lényege: Az ammónia kolorimetriás meghatározása a talajminta és a húgysavoldat 37°C-on, 2 órán át tartó inkubálása után. Szükséges eszközök: 37°C-ra állítható inkubátor Rázó Szűrőpapír Spektrofotométer Mérőlombikok (100, 500, 1000, 2000 ml) Erlenmeyer lombik (50, 100 ml)

Kandeler-Gerber II. - Vegyszerek és oldatok 1. Húgysavoldat Oldjunk fel 2.4 g húgysavat 400 ml desztillált vízben, majd töltsük fel 500 ml-ig desztillált vízzel (naponta újat készítünk belőle) KCl oldat 74.6 g KCl-ot feloldunk desztillált vízben, majd hozzáadunk 10 ml 1M-os HCl-ot, és desztillált vízzel feltöltjük 1000 ml-re. NaOH (0.3 M) 12 g NaOH-ot oldunk desztillált vízben, majd szintén desztillált vízzel 1000 ml-re töltjük fel. Nátrium-szalicilát oldat 17 g Na-szalicilátot és 120 mg nitroprusszid-nátriumot oldunk desztillált vízben, majd 100 ml-re töltjük desztillált vízzel. Na-szalicilát/NaOH oldat Egyenlő mennyiségű NaOH oldatot, Na-szalicilát oldatot és desztillált vizet keverünk össze. (naponta újat kell belőle készíteni)

Kandeler-Gerber III. – Vegyszerek és oldatok 2. Nátrium-diklór-izocianid oldat (0.1%) 0.1 g nátrium-diklór-izocianátot oldunk 100 ml desztillált vízben (közvetlenül használat előtt készítjük el) Borát puffer (pH 10) 56.85 g dinátrium-tetraborátot, vagy 30g vízmentes dinátrium-tetraborátot oldunk 1500 ml meleg desztillált vízben. Hűlés után annyi 20%-os NaOH-t adunk hozzá, hogy pH-ja 10 legyen, majd 2000 ml-re töltjük fel desztillált vízzel Ammónium-standard oldat I. oldat: 3.82 g ammónium-kloridot oldunk desztillált vízben, majd 1000 ml-re töltjük (1000μg NH4-N/ml) Az oldat 4°C-on tárolva több hétig stabil marad II. oldat: 0.0, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5 ml I. oldatot pipettázunk 100 ml-es mérőlombikokba, majd KCl oldattal 100 ml-re töltjük őket.

Kandeler-Gerber III. – A meghatározás menete: a nem pufferelt módszer 5g nedves talajmintát helyezünk a 100 ml-es Erlenmeyer lombikba, és hozzáadunk 2.5 ml húgysavoldatot. Ezt 2 órán át 37°C-on inkubáljuk, majd 50 ml KCl oldat hozzáadása után az egész lombikot 30 percen keresztül rázatjuk. A kapott szuszpenzió szűrése után, a szűrlet ammóniumtartalma mérhető. Ammónia-meghatározás: 1 ml tiszta szűrletet pipettázunk az 50 ml-es Erlenmeyer lombikba, majd hozzáadunk 9 ml desztillált vizet, 5 ml Na-szalicilát/NaOH oldatot és 2 ml nátrium-diklór-izocianát oldatot, majd 30 percig szobahőmérsékleten állni hagyjuk, majd a 690 nm-en mérjük az optikai denzitást.

Kandeler-Gerber III. – A meghatározás menete: a pufferelt módszer - Kalibrálás 5g nedves talajmintát helyezünk 100 ml-es Erlenmeyer lombikba, és hozzáadunk 2.5 ml húgysavat és 20 ml borát puffert. A további lépések megegyeznek a nem pufferelt változat lépéseivel, de a végén 30 ml KCl-ot adunk hozzá az inkubáció után. Kalibrálás: 1 ml ammónium standard II. oldatot pipettázunk a kémcsövekbe és 9 ml desztillált vízzel hígítjuk, majd meghatározzuk az ammónium koncentrációkat (0, 1, 1.5, 2, 2.5 μg NH4-N/ml)

Kandeler-Gerber IV. - Számítás Számolás: Ureáz aktivitás (μg NH4-N g-1 dwt*2h-1)= ((μg NH4-N/ml) × V ×10)/(dwt × 5) Ahol dwt: 1 g nedves talaj száraz tömege V: 52.5 ml, a minta teljes térfogata 10: a hígítási arány 5: a meghatározáshoz használt talaj tömege

Megjegyzések Tabatabaiék módszerében a puffer megakadályozza a NH4+ ionok kötődését a talajban, így a pufferelt közegben nagyobb ureáz aktivitás adódik, mint a nem pufferelt közegben. A KCl-Ag2SO4 oldat készítésekor fontos, hogy a KCl-ot oldjuk az ezüst-szulfátban, mert az ezüst szulfát nem oldódik a kálium-kloridban. Erre az oldatra azért van szükség, hogy megakadályozza az enzimreakciót, így a szuszpenzió tud 2 órát állni ammónium felszabadulása nélkül. Kandelerék módszerében nem használunk ilyen inhibítort, de a KCl itt is lelassítja a reakciót. A szűréskor ügyelni kell, hogy a szűrőpapír nitrogénmentes legyen, hogy megelőzzük a nitrogénmegkötődést a szűrletben. Az ammónium vizsgálathoz előállított színreakció szobahőmérsékleten 8 óráig stabil marad. A kolorimetriás meghatározás nem ajánlott a sok nehézség miatt, mint a reagensek vagy a színes vegyületek instabilitása, a nehézkes ismételhetőség, az alacsony érzékenység, az alacsony húgysav-koncentrációk, stb.

Köszönöm a figyelmet!

Források: Alef K. and Nannipieri P. (Editors): Methods in Applied Soil Microbiology and Biochemistry, Academic Press Limited, London, 1995 http://hu.wikipedia.org/wiki/Enzim :enzimműködés képek, bevezető az enzimekről http://taplalkozas.bioenergetikus.hu/enzimek.html :bevezető az enzimekről http://160.114.99.91/astrojan/protein/pictures/urease.jpg :ureáz képe http://www.vilaglex.hu/Kemia/Html/Ureaz.htm bevezető az ureázról