ELVÁLASZTÁSTECHNIKA V. KROMATOFOKUSZÁLÁS KIRÁLIS, ZÁRVÁNY-KOMPLEX KROMATOGRÁFIA IMMOBILIZÁLT FÉMION AFFINITÁSI KROMATOGRÁFIA Dr. Kremmer Tibor EÖTVÖS LORÁND TUDOMÁNY EGYETEM Budapest

KROMATOFOKUSZÁLÁS CHROMATOFOCUSING

pH GRADIENS ELŐÁLLÍTÁSA KROMATOFOKUSZÁLÁS SLUYTERMAN (1977) KROMATOGRÁFIÁS ELVÁLASZTÁS IZOELEKTROMOS PONT (pI) ALAPJÁN pH GRADIENS ELŐÁLLÍTÁSA IONCSERE ELVÉNEK FELHASZNÁLÁSA GÉLKROMATOGRÁFIA ELVÉNEK FELHASZNÁLÁSA

(pH, IONERŐSSÉG, KONCENTRÁCIÓ, POLARITÁS) KROMATOFOKUSZÁLÁS GRADIENS KÉPZÉS (pH, IONERŐSSÉG, KONCENTRÁCIÓ, POLARITÁS) pH B > A A B V

KROMATOFOKUSZÁLÁS - pH-GRADIENS KÉPZÉS

A pH GRADIENS ALKALMAZÁSÁNAK MÓDJAI KROMATOFOKUSZÁLÁS A pH GRADIENS ALKALMAZÁSÁNAK MÓDJAI IONCSERÉLŐ - GÉLKROMATOGRÁFIÁS TÖLTETBE VEZETETT pH GRADIENS IONOS (IONCSERÉLŐ) TÖLTETEN AMFOLITTAL KIALAKÍTOTT pH GRADIENS INERS HORDOZÓN (GÉLSZEMCSE) KOVALENS KÖTÉSSEL RÖGZÍTETT (IMMOBILIZÁLT) pH GRADIENS

KROMATOFOKUSZÁLÁS IONCSERÉLŐ – GÉLKROMATOGRÁFIÁS TÖLTETEN ELŐFELTÉTELEK AZ IONCSERÉLŐ AZ ELVÁLASZTÁS TELJES pH TARTOMÁNYÁBAN ÁLLANDÓ (POZITÍV VAGY NEGATÍV) TÖLTÉSŰ LEGYEN A FEHÉRJÉK BIZTOSAN KIZÁRÓDJANAK A GÉLSZEMCSÉK PÓRUSAIBÓL A pH GRADIENS OPTIMÁLIS SZAKASZA MEGFELELJEN A FEHÉRJÉK IZOELEKTROMOS PONTJÁNAK A FEHÉRJÉK IZOELEKTROMOS PONTJA AZ ELVÁLASZTÁS pH TARTOMÁNYÁNAK KÖZEPÉN LEGYEN

+ + + + + + + pH pI (3X) 4 4,9 5 6 5,0 7 KROMATOFOKUSZÁLÁS - 1 + + + + Áramlás iránya KROMATOFOKUSZÁLÁS - 1

+ + + + + + + pH pI (3X) 4 5 4,9 6 7 5,0 KROMATOFOKUSZÁLÁS - 2 + + + + Áramlás iránya KROMATOFOKUSZÁLÁS - 2

+ + + + + + + pH pI 4 5 4,9 6 7 5,0 + + + KROMATOFOKUSZÁLÁS - 3 pH + + + + + 5,0 + + Áramlás iránya KROMATOFOKUSZÁLÁS - 3

+ + + + + + + pH pI 4 4,9 5 6 5,0 7 - - - KROMATOFOKUSZÁLÁS - 4 + 5,0 + + Áramlás iránya KROMATOFOKUSZÁLÁS - 4

+ + + + + + + pH pI 4 4,9 5 6 5,0 7 KROMATOFOKUSZÁLÁS - 5    +    5,0 + + Áramlás iránya KROMATOFOKUSZÁLÁS - 5

+ + + + + + + pH pI 4,9 4 5 5,0 6 7 - - - KROMATOFOKUSZÁLÁS - 6 + + Áramlás iránya KROMATOFOKUSZÁLÁS - 6

+ + + + + + + pH pI 4,9 4 5 6 5,0 7 - - - KROMATOFOKUSZÁLÁS - 7 + 5,0 + - - - + Áramlás iránya KROMATOFOKUSZÁLÁS - 7

KROMATOFOKUSZÁLÁS IONCSERÉLŐ – GÉLKROMATOGRÁFIÁS TÖLTETEN ELŐFELTÉTELEK A FEHÉRJE IZOELEKTROMOS PONTJA AZ ELVÁLASZTÁS pH TARTOMÁNYÁNAK KÖZEPÉN LEGYEN AZ IONCSERÉLŐ AZ ELVÁLASZTÁS TELJES pH TARTOMÁNYÁBAN ÁLLANDÓ (POZITÍV VAGY NEGATÍV) TÖLTÉSŰ LEGYEN A FEHÉRJE BIZTOSAN KIZÁRÓDJON A GÉLSZEMCSÉK PÓRUSAIBÓL A pH GRADIENS OPTIMÁLIS SZAKASZA MEGFELELJEN A FEHÉRJE IZOELEKTROMOS PONTJÁNAK

KROMATOFOKUSZÁLÁS IONCSERÉLŐN AMFOLITTAL MULTIFUNKCIÓS ANIONCSERÉLŐ OSZLOP EGYENSÚLYBA HOZVA pH = 7 PUFFERREL ELÚCIÓ (MINTA FELVITEL) MEGFELELŐ pI - TARTOMÁNYÚ AMFOLITOT (AMFOTER POLIELEKTROLIT) TARTALMAZÓ pH = 4,2 PUFFERREL AZ ELUCIÓ SORÁN AZ AMFOLIT MEGTITRÁLJA AZ IONCSERÉLŐT ÉS pH-GRADIENST HOZ LÉTRE, AMELYBEN A FEHÉRJE MOLEKULÁK pI ÉRTÉKÜKNEK MEGFELELŐEN KÖTÖDNEK ÉS KÜLÖNBÖZŐ RETENCIÓVAL OLDÓDNAK LE

REFERENCIA FEHÉRJÉK ELVÁLASZTÁSA KROMATOFOKUSZÁLÁSSAL (Cytochrom C – Ribonuclease – Lentil-lectin)

L – Aminosav oxidáz izoenzimek elválasztása kromatofokuszálással Mono P oszlopon

KROMATOFOKUSZÁLÁSSAL HAEMOGLOBIN VARIÁNSOK ELVÁLASZTÁSA KROMATOFOKUSZÁLÁSSAL

IZOM FEHÉRJÉK ELVÁLASZTÁSA KROMATOFOKUSZÁLÁSSAL

TOJÁS FEHÉRJÉK ELVÁLASZTÁSA KROMATOFOKUSZÁLÁSSAL

KIRÁLIS ZÁRVÁNY - KOMPLEX KROMATOGRÁFIA

A KIRALITÁS ELVE Glicerinaldehid Enantiomerek

ENANTIOMEREK ELVÁLASZTÁSA KIRÁLIS (ZÁRVÁNY - KOMPLEX) KROMATOGRÁFIÁVAL KÖZVETETT MÓDSZEREK SZÁRMAZÉK KÉPZÉS KOVALENS KÖTÉSSEL, KIRÁLIS VEGYÜLETTEL ELVÁLASZTÁS NORMÁL, VAGY FORDÍTOTT FÁZISON FIZIKAI-KÉMIAI TULAJDONSÁGOK ELTÉRÉSE ALAPJÁN Pl. MARFEY – REAGENS (1-FLUORO-2,4 DINITROFENIL 5 L-ALANIN ELŐNYÖK KÖVETELMÉNYEK REAKCIÓ SEBESSÉG NEM BEFOLYÁSOL, KROMATOGRÁFIA KÖRÜLMÉNYEIVEL JÓL OPTIMÁLHATÓ, SZELEKTIVITÁS, DETEKTÁLÁS NÖVELHETŐ, MINTA ELŐTISZTÍTHATÓ, ANTIPÓDOK KÜLÖN ALKALMAZHATÓK REAGENS OPTIKAI TISZTASÁGA, KROMOFOR CSOPORT IGÉNYE, MINDKÉT ANTIPÓD KELL, REPRODUKÁLHATÓ-KVANTITATÍV REAKCIÓ, STABIL, EGYSÉGES SZÁRMAZÉK-TERMÉK

KÖZVETLEN MÓDSZEREK ENANTIOMEREK ELVÁLASZTÁSA KIRÁLIS (ZÁRVÁNY - KOMPLEX) KROMATOGRÁFIÁVAL KÖZVETLEN MÓDSZEREK KIRÁLIS ADALÉKANYAGOK ALKALMAZÁSA CIKLODEXTRINEK - KORONAÉTEREK KOMPLEX - IONPÁR KÉPZŐK EGYÉB LIGANDUMOK AZ ÁRAMLÓ FÁZISBAN (dinamikus módszerek) AZ ÁLLÓ FÁZISON KÖTVE – KIRÁLIS ÁLLÓ FÁZISOK (sztatikus módszerek)

KIRÁLIS (ZÁRVÁNY - KOMPLEX) KROMATOGRÁFIA AZ ÁRAMLÓ FÁZISBAN KIRÁLIS ADALÉKANYAGOK ALKALMAZÁSA AZ ÁRAMLÓ FÁZISBAN ZÁRVÁNY KOMPLEX KÉPZŐK CIKLODEXTRIN SZÁRMAZÉKOK, KORONA ÉTEREK TERNER KOMPLEXEK (FÉMION – KIS LIGANDUM - ENANTIOMER) DIASZTEREOMER – IONPÁR KÉPZŐ KOMPLEXEK AZ ÁLLÓ FÁZIS FÁZIS FELÜLETÉN KIRÁLIS ELLENIONNAL (KÁMFOR SZULFONSAV, KININ-KINIDIN, PIRROLIDIN KARBONSAVAK)

AZ ÁLLÓ FÁZISBAN KIRÁLIS ÁLLÓ FÁZISOK KIRÁLIS (ZÁRVÁNY - KOMPLEX) KROMATOGRÁFIA KIRÁLIS ADALÉKANYAGOK ALKALMAZÁSA AZ ÁLLÓ FÁZISBAN KIRÁLIS ÁLLÓ FÁZISOK ZÁRVÁNY KOMPLEX KÉPZŐK (KOVALENSEN KÖTÖTT CIKLODEXTRIN SZÁRMAZÉKOK, KORONAÉTEREK) PIRKLE-TIPUSÚ FÁZISOK (3,5-DINITRO-BENZIL l-AMINOSAV) CELLULÓZ ALAPÚ FÁZISOK (ACETÁT, KARBAMÁT, IZOTIOCIANÁT,BENZOÁT ÉSZTEREK) MAKROCIKLUSOS GLIKOPEPTIDEK (VANCOMYCIN) FORDÍTOTT (REVERSED) AFFINITÁSI KROMATOGRÁFIÁS FÁZISOK - MAKROMOLEKULÁRIS KÖTÖTT LIGANDUMOK (ALBUMIN, AGP, OVOMUKOID, AVIDIN, KIMOTRIPSZIN, STB.) LIGANDUM CSERE ELVÉN ALAPULÓ FÁZISOK

KORONA ÉTEREK CIKLODEXTRINEK ZÁRVÁNY-KOMPLEX KÉPZŐK A KIRÁLIS KROMATOGRÁFIÁBAN KORONA ÉTEREK CIKLODEXTRINEK

A KIRÁLIS KÖLCSÖNHATÁSOK 3 PONTOS SZABÁLYA A KIRÁLIS KÖLCSÖNHATÁSOK TIPUSAI DIPOL – DIPOL  -  (SAV-BÁZIS) H – DONOR, AKCEPTOR TÉRIGÉNY GÁTLÁS ZÁRVÁNY KÉPZŐDÉS KOMPLEX KÉPZÉS, LIGANDUM CSERE, KIRÁLIS KÖRNYEZET (HELIX) AROMÁS GYŰRŰ HATÁSOK, MEREV MOLEKULA SZERKEZET

CIKLODEXTRINEK (CD) -CD β-CD -CD Molekula összetétel C36H60O30 n (glukóz egység) 6 7 8 Molekula tömeg (g/mol) 972.86 1135.01 I297.15 Specifikus optikai rotáció (g/mol) 150.5 162. 5 177.4 Oldékonyság vizben (súly %, 25OC) 14.50 1.85 23.20 Üregátmérő (Å) 4.7 6.0 7.5 Üregtérfogat (A3) 174 262 427 Üregtérfogat /g (ml) 0.10 0.14 0.20 Víz ekvalens az üregben 11 17 pK3 a hidroxil csoportokra 12.33 12.20 12.08 Zárvány vegyület Benzol Naftalin Antracén

A CIKLODEXTRINEK SZERKEZETE

A CIKLODEXTRINEK MOLEKULA SZERKEZETE

GABA-RECEPTOR SPECIFIKUS ANALOG VEGYÜLET (rac-NSC 382) enantiomerek (R, S) elválasztása CELLULÓZ-p-METIL BENZOESAV ÉSZTER OSZLOPON (CHIRALCEL OJ, DAICEL) MolnárT, Visy J et al. Bioorg. Med. Chem. Lett. (2008)

Oxazepam enantiomerek (R, S) királis elválasztása BSA-HPLC oszlopon Fitos, I., Visy, J., Simonyi, M. and Hermansson, J. (1995). Separation of enantiomers of benzodiazepines on the Chiral-AGP column. J. Chromatogr. A, 709, 265-273. Oxazepam enantiomerek (R, S) királis elválasztása BSA-HPLC oszlopon (0,01M foszfát puffer, pH: 7,0 2% ACN) Fitos I, Visy J, Simonyi M. J. Biochem. Biophys. Methods (2002) rac-NCS 382

rac-Oxazepam és rac-oxazepam hemiszukcinát enantiomerek elválasztása Chiral-AGP oszlopon (0,01M foszfát puffer, pH:7,0 5% ACN) Fitos I, Visy J. et al. J Chromatogr. (1995) rac-NCS 382

KÜLÖNBÖZŐ HIDANTOIN ÉS BARBITURÁT SZÁRMAZÉKOK KIRÁLIS ELVÁLASZTÁSA ChiraSep DN BP6 OSZLOPON (HEXÁN-2-PrOH-ACN)

AFFINITÁSI KROMATOGRÁFIA IMMOBILIZED METAL ION AFFINITY CHROMATOGRAPHY IMMOBILIZÁLT FÉM ION (KELÁT - KOMPLEX) AFFINITÁSI KROMATOGRÁFIA IMAC IMMOBILIZED METAL ION AFFINITY CHROMATOGRAPHY

IMMOBILIZÁLT FÉM ION (KELÁT-KOMPLEX) AFFINITÁSI KROMATOGRÁFIA IMAC

HUMÁN SZÉRUM AGP IMAC VIZSGÁLATA