Egészségkárosító kémiai hatások és megelőzésük Genotoxikológiai vizsgálati módszerek ismertetése Előadó: Dr. Kocsis Zsuzsanna Országos Kémiai Biztonsági Intézet Budapest, Nagyvárad tér 2. Helyszín: ELTE, TTK 2009. 11. 14

A sejtmagban tárolt információ összessége a genom. Az emberi genom a két szülőtől származó,apai és anyai eredetű, DNS szálak közel azonos információkat tartalmaznak. A sejtosztódás során a DNS szálak fénymikroszkóposan látható kromoszómává tömörülnek.

Kromoszómaalak (morfológia) rövid kar centroméra hosszú kar Kariogram: egy sejt/szervezet rendezett kromoszómakészlete Kariotípus: a fajra jellemző kariogram testvérkromatid

A genotioxikológia az emberrel közvetlenül kapcsolatba kerülő anyagok mutagén hatását vizsgálja. Genotoxikus anyagok a DNS-ben tárolt genetikai információt örökletes módon megváltoztatják.

Mutáció: Egy tulajdonság egy nemzedéken belül ugrásszerűen, és öröklődő módon megváltozik. pl. enzimhiány, anyagcserezavarok, molekuláris megbetegedések Mutációk csoportosítása eredetük szerint *spontán mutáció: természetes körülmények közt minden fajra jellemző gyakorisággal lép fel. Prokariótáknál nagyobb, mint az eukariótáknál, a mitokondriális genomban nagyobb, mint a nukleáris genomban. *indukált mutáció: környezeti hatásra létrejövő ill. kísérleti körülmények között kiváltott mutációk.

Mutációk csoportosítása az érintett sejtvonal szerint:. szomatikus Mutációk csoportosítása az érintett sejtvonal szerint: * szomatikus *germinális Mutációk csoportosítás a hatópont szerint: *gén- v. pontmutációk: *kromoszóma mutációk: MUTAGÉN TÉNYEZŐK sugárzás (röntgen, ultraibolya, radioizotópok) molekulákat gerjesztik és ionizálják. kémiai anyagok: hatásmechanizmusok alapján lehetnek: bázisanalógok interkaláló vegyületek alkiláló vegyületek N-nitróz vegyületek szabadgyököt képező vegyületek nehézfémek DNS-szintézis inhibitorok

Környezeti mutagén anyagok élelmiszeradalékok: nitritek, nitrátok nátriumbisziulfit ciklohexamin kozmetikumok: hajfesték (nitrofenilén-diamin) H2O2 femnilén-diamin diaminotoluol diaminoanizol gyógyszerek:citosztatikumok, altató és nyugtató szer antiallergiás gyógyszerek Meclizin fertőtlenítőszerek (formaldehid, H2O2) növényvédőszerek, herbicidek, insecticidek: klórozott szénhidrogének szerves-foszforsav észterek karbamidok, karbamátok, ftálamidok, szerves higanyvegyületek Vegyiparban használt köztes és végtermékek: epoxidok etilén-iminek acetaldehid akrilaldehid propán szulfon dimetil szulfát dietil szulféát dimetil-nitrózamin hidrazinok uretán etilén klorid vinil klorid Levegőszennyezés: policiklikus aromás szénhidrogének Szervetlen mikroszennyezők: nehézfémek azbeszt Szerves mikroszennyezők: gomba és baktériumok által termelt toxinok

KROMOSZÓMA ABERRÁCIÓ TÍPUSAI: Strukturális kromoszóma aberráció: deléció inszerció transzlokáció Numerikus kromoszóma aberráció: poliploidia aneuploidia

kromoszóma szegmentek elvesztése Deléció kromoszóma szegmentek elvesztése Különböző humán betegségek delécióra vezethetőek vissza. A kis deléciók tolerálhatóak. A nagy deléciók nem tolerálhatóak, letalitáshoz vezetnek. Egyes gének kiesésével a homológ kromoszómán hemizigóta állapot alakul ki. Egy recesszív tulajdonság felszínre jut. Ennek következménye, hogy a recesszív gén is megjelenhet a fenotípusban. Ezt a fenotípust pseudodominánsnak nevezzük.

Deléció citológiai detektálása Az 5-ös kromoszóma rövid karján deléciója Macska nyávogásos betegség Szellemi visszamaradottság 4 év alatti halál születéskori gyakoriság: 1/50,000

DUPLIKÁCIÓ: Kromoszóma szegmensek megkettőződése. Jó példa a duplikációra a Drosophila Bar mutációja.

Az X kromoszóma 16A régiójának kópia száma különböző

A gének evolúciójában fontos a duplikáció. Ha a gén fontos a szervezet számára nem változhat. De ha a génből több kópia van a képződő proteinek módosulhatnak és új funkciókat láthatnak el. Duplikációval keletkezett gén családok hasonló proteineket készítenek. Jó példa erre a globin gének, amelyekről α és β globin láncok szintetizálódnak, a hemoglobin szerkezeti alegységei.

Inverzió: Egy kromoszóma szakasz 180 fokos megfordulásának az eredménye. pericentrikus inverzió magába foglalja centromert paracentrikus inverzió a centromert nem érinti, csak a kromoszóma egyik v. másik karját

intrakromoszómális transzlokáció: Egy kromoszóma szakasz áthelyeződése ugyanabba a kromoszómába. interkromoszómális transzlokáció: Nem homológ kromoszómák közötti transzlokáció. Transzlokáció során nincs genetikai anyag vesztés. A gének pozíciója azonban megváltozik.

14 és 21-es kromoszóma közötti Robertson transzlokáció. Down szindróma: 14 és 21-es kromoszóma közötti Robertson transzlokáció. A 21-es krom. transzlokációja a 14-es krom.-ra eredményezi a familiáris Down syndromát. 21-es kromoszóma triszómia Az anya életkorának előrehaladtával (40-45 év felett) az előfordulási gyakoriság exp. növekszik Születéskori gyakorisága nagy: 1/500-1/700

Myeloid leukémia A 9-es és a 22-es kromoszómák közötti transzlokáció eredménye a “Philadelphia kromoszóma” Az esetek 90%-ban krónikus myeloid leukemiát okoz.

Burkitt’s lymphoma Az esetek 90% esetén a 8-as és 14-es kromoszómák közötti transzlokáció következménye. Transzlokáció következtében kialakuló pozíció effektus hatására kialakuló onkogének, sejtosztódást, rák keletkezését okozhatják.

Ajánlott teszt rendszerek: Egysejtűeken végzett tesztek Rovartesztek Genotoxikus és daganatkeltő hatások vizsgálatának alapelvei a vizsgálati anyag in vitro teszt rendszerekben mutagén-e ? a vizsgálati anyag mutagén-e in vivo emlős szomatikus vagy ivarsejtekben ? Ajánlott teszt rendszerek: Egysejtűeken végzett tesztek Rovartesztek in vitro sejtkultúrákon végzett tesztek in vivo mutagenitási tesztek long term karcinogenitási állatkísérletek humán epidemiológiai vizsgálatok

Alternatív toxikológiai in vitro vizsgálatok előnyei: in vitro körülmények között sejteken (élő állat alkalmazása nélkül ) rövid idejű olcsóbb reprodukálható nem használ élő állatot Az esetleges hatás megállapításához több, különböző módszerrel végzett vizsgálat egybehangzó eredményére van szükség. A WHO Nemzetközi Rákkutató Ügynöksége (IARC) 1. kategória: emberben bizonyítottan daganatkeltő hatású anyag

Kromoszóma aberráció in vitro vizsgálata emlős sejteken MUTAGÉN HATÁS VIZSGÁLATA In vitro módszer Kromoszóma aberráció in vitro vizsgálata emlős sejteken OECD TG 473 Gazdasági Együttműködési és Fejlesztési Szervezet (OECD) Célja: azon anyagok meghatározása, amelyek kromoszóma aberrációt okoznak emlősállat sejtekben. Kr

A kromoszóma aberráció vizsgálati módszer: Sejtek (Tud. történet: Sejttenyésztés kezdeti lépései: csirkeembrió/békaembrió, szövetdarab 50-60 osztódás után öregedés jegyei. 1940 egér L sejt fibroblaszt 1951 méhnyakráksejt HeLa) Alkalmazható sejtvonalak jellemzői: stabil permanens v. primer sejtkultúrák (pl. CHO, humán lymfocita) növekedési képesség stabilitás: megkettőződési idő stabil és rövid. kariotípus stabilitás, állandó krom. szám. Kromoszómák alaki változatossága és stabilitása. Spontán kromoszóma ab. gyak. megfelelő, nem túl magas. kínai hörcsög ovárium fibroblaszt sejt (CHO) Tápfolyadékok, tenyésztési körülmények (Természetes sóoldat, tojás fehérje, nyirok , vérplazma) Mesterséges tápfolyadékok elterjedése (F12).

Vizsgálati anyag előkészítése: kémiai összetétel, szennyeződés, stabilitás oldószer kiválasztása hígítási sor készítése stabilitás vizsgálat (archiválás) Előkísérlet: ctox vizsg. esetleg mitotikus index meghatározása. Ctox: MTT-assay (mitokondriális szukcinát dehidrogenáz enzim) MI: A metafázisban lévő sejtek és a sejtpopuláció összes sejtjének aránya. A populáció proliferációjának a mértékét jellemzi. Dózisok: Legkevesebb három elemezhető dózis. Citotoxikus anyag: ctox >50% a legmagasabb dózis. Nem citotoxikus anyag: 5 mg/ml v. 0,01M

Metabolikus aktiválás: S9 alkalmazása rákcsálók enziminducerrel (Aroclor 1254, v. fenobarbiturát és β-naftoflavon) kezelt májából előállított poszmitokondriális frakció (S9) kofaktorokkal kiegészítve (ADPH, glukóz-6-foszfát). S9 végkoncentráció 1-10% közötti. citokróm P450 enzim aktiválása. Indirekt mutagének kimutatására alkalmas

Kontrollok: Kezelési idők: S9 nélkül: MMS, EMS, Mitomycin-C + S9: CP, Benz(a)pirén oldószer Kezelési idők: 4 óra +S9 4 óra -S9 24 óra -S9 48 óra -S9

Célja a metafázisos kromoszómák összegyűjtése Kolhicinezés: Célja a metafázisos kromoszómák összegyűjtése Őszi kikerics (Colchicum autumnale) hagymájából készült kivonat. Köszvény gyógyítására alkalmazták. A kolhicin sejtosztódás gátló, a mitózis metafázisában. Normál esetben a sejtek 2-5%-a osztódik, néhány órás kolhicinezés összegyűjti a sejteket a metafázisban, akár 40-50 %-uk is blokkolt metafázisban található. A kolhicin a magorsó mikrotubulusaihoz kötődik.

Kromoszóma preparálás

Fénymikroszkópos értékelés kromatid típusú aberrációk: kromoszóma típusú aberrációk: deléció deléció exchange exchange